포유 동물 세포의 DNA 이중 가닥 브레이크 (DSB) 수리 분석
Summary
이 문서는 GFP 기반의 형광을 설명합니다<em> 생체내에</em> 별도로 상동 재조합을 계량하고 nonhomologous 포유 동물 세포에 입사 최종 assays.
Abstract
DNA 이중 가닥의 휴식 시간은 유전 정보 및 세포 사망의 대규모 손실로 이어질 수있는 가장 위험한 DNA의 병변입니다. 가입 nonhomologous 엔드 (NHEJ)와 상동 재조합 (HR) : 두 가지 주요 경로를 사용하여 셀 수리 DSBs. NHEJ와 HR의 Perturbations 자주 조기 노화와 tumorigenesis와 관련된, 따라서 그것은 각 DSB 복구 경로을 측정하는 양적 방법이 중요합니다. 저희 연구실은 NHEJ와 HR의 민감하고 정량적 측정을 허용 형광 리포터 구조를 개발했습니다. 구성은 DSBs의 유도를위한 드문 절감 I – SceI의 endonuclease에 대한 인식 사이트를 포함하는 설계 GFP 유전자를 기반으로합니다. GFP 유전자가 추가 엑슨에 의해 inactivated, 또는 돌연변이에 의해 그대로 시작 구조는 GFP 아무것도 없습니다. NHEJ 또는 HR하여 I – SceI 유발 나누기의 성공적인 복구 기능 GFP 유전자를 복원합니다. 유동세포계측법로 가늠 GFP 양성 세포의 수는 NHEJ 또는 HR 효율 양적 측정을 제공합니다.
Protocol
Discussion
형광 NHEJ 및 인사 기자 assays은 별도로 생체내 각 DSB 복구 경로를 측정하기위한 양적 방법을 제공합니다. 외과 안정 20000 세포에서 10 GFP의 + 세포를 검색할 수 assays 매우 민감합니다. assays는 DSBs 2의 유도 후 몇 분, 아님 몇 시간 이내에 GFP + 세포의 모양을 감지하여 "실시간"에 복구 이벤트를 측정하기위한 적응 수 있습니다. 또한, GFP + 세포의 분석 DSB 복구가 다양한 약물 치료되…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원래 GFP – Pem1 박사 레이 리의 선물했다. 이 작품은 NIH와 엘리슨 의료 재단에서 VG에 부여하여 이름으로 지원했습니다
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | ||
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | ||
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001 | ||
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | ||
| pDsRed2-N1 | Clontech | 632406 | ||
| Round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | FACS tubes |
References
- Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y., Gorbunova, V. TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13068-13073 (2007).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).
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