Анализ ДНК двухцепочечной Break (DSB) Ремонт в клетках млекопитающих
Summary
В этой статье описывается GFP основе флуоресценции<em> В естественных условиях</em> Анализы, что отдельно количественно гомологичной рекомбинации и негомологичных конце вступление в клетках млекопитающих.
Abstract
ДНК двухцепочечной разрывы самых опасных повреждений ДНК, что может привести к массовой гибели генетической информации и гибели клеток. Клетки ремонт ДР с использованием двух основных путей: негомологичных конце соединения (NHEJ) и гомологичной рекомбинации (HR). Возмущения NHEJ и HR часто связаны с преждевременным старением и опухолей, поэтому важно иметь количественный способ измерения каждого пути DSB ремонта. Наша лаборатория разработала флуоресцентный конструкций репортеру, что позволит чувствительной и количественного измерения NHEJ и HR. Конструкции на основе генной инженерии GFP содержащие сайты узнавания для редких резки I-SCEI эндонуклеазы для индукции ДР. Начиная конструкции GFP отрицательным, как ген GFP инактивируется дополнительные экзона, либо мутаций. Успешный ремонт I-SCEI вызванные перерывами на NHEJ или HR восстанавливает функциональный ген GFP. Число GFP-положительных клеток рассчитывали с помощью проточной цитометрии обеспечивает количественную меру NHEJ или HR-эффективности.
Protocol
Discussion
Флуоресцентные NHEJ и анализы HR репортер обеспечить количественный способ измерения отдельно каждого пути DSB ремонт в естественных условиях. Тесты очень чувствительны, как FACS может надежно обнаружить 10 клеток GFP + в 20000 клеток. Анализы могут быть адаптированы для измерения ремонт со?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Оригинальные GFP-Pem1 был подарок от доктора Лэй Ли. Эта работа была поддержана грантами NIH и Эллисон Медицинский фонд В. Г. и А. С.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | ||
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | ||
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001 | ||
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | ||
| pDsRed2-N1 | Clontech | 632406 | ||
| Round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | FACS tubes |
References
- Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y., Gorbunova, V. TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13068-13073 (2007).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).
- Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells. Neoplasia. 11, 683-691 (2009).
- Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells. Cell Cycle. 7, 2902-296 (2008).
