Agar-montage: een basismethode voor het monteren van levende zebravisembryo's voor langdurige beeldvorming

Overview

Deze video beschrijft stap voor stap instructies voor het monteren van levende zebravisembryo's op 6 putplaat met behulp van laag smeltagarose. Het biedt ook het proces om beelden van levende embryo's te verkrijgen en deze te analyseren met behulp van software.

Protocol

1. Microscoopopstelling, beeldverwerving, verwerking en analyse

1. Bereid 0,8% laag smeltpunt (LMP) agarose: Voeg 0,8 g LMP agarose toe aan 100 ml E3 en verwarm tot het volledig is opgelost. Tijdens het heet, aliquot 1 ml LMP agarose in 1,5 ml microfuge buizen in een 37 °C verwarmingsblok. De LMP-agarose blijft gesmolten bij 37 °C. Voeg 40 μl 4 mg/ml (25x), pH 7,0 tricaïne toe aan elke 1 ml aliquot LMP agarose bij 37 °C. OPMERKING: Als u met een gepigmenteerde stam werkt, voeg dan 20 μl 0,15% (50x) PTU toe aan elke 1 ml aliquot.
   1. Bewaar de resterende LMP-agarose gedurende enkele maanden in verzegelde tubes van 50 ml bij 4 °C.
2. Verdoof parabiotische embryo's die moeten worden afgebeeld door 1 ml 4 mg/ml (25x), pH 7,0 tricaïne toe te voegen aan de 25 ml E3 waarin de embryo's zich al bevinden.
3. Draai de schaal voorzichtig zodat de embryo's in het midden poolen. Trek vervolgens met behulp van een brede plastic transferpipet de embryo's in zo min mogelijk vloeistof op. Draai de pipet rechtop en stuiter de embryo's voorzichtig zodat ze zich tot de bodem van de pipet nestelen.
   1. Met de embryo's aan de onderkant van de pipet, breng ze over op een 1 ml aliquot LMP-agarose door de pipetpunt lichtjes aan te raken op het oppervlak van de agarose. Vermijd het overbrengen van overtollige vloeistof, omdat dit de agarose zal verdunnen.
4. Nadat u de overtollige vloeistof uit de pipet hebt verdreven, gebruikt u de pipet om de embryo's voorzichtig in de agarose te mengen en gebruikt u vervolgens de pipet om alle agarose en embryo's over te brengen naar de put van een glazen bodem (nr. 1.5 coverslip), 6-well plaat.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u de pipet weggooit nadat u de embryo's naar de beeldplaat hebt overgebracht. Resterende agarose zal in de pipet worden geplaatst, waardoor deze niet effectief is voor verder gebruik. Gebruik in plaats daarvan elke keer een nieuwe pipet.
5. Gebruik onder een stereoscope een gelbeladingspipettip die aan het uiteinde van een met hout behandelde plaagnaald is bevestigd om de embryo's naar beneden in de richting van het afdekglas te plaatsen (om ervoor te zorgen dat ze zich binnen de werkafstand van het microscoopdoel bevinden) en in de gewenste oriëntatie voor beeldvorming.
   OPMERKING: Herpositioneer continu totdat de agarose volledig is ingesteld. Zorg ervoor dat u de parabiotische embryo's monteert volgens welke embryo van het paar moet worden afgebeeld. Gezien de willekeurige oriëntatie van de samengevoegde embryo's, kan het voor sommige paren moeilijk zijn om beide embryo's in beeld te krijgen. In dit scenario, herstel de embryo's van de agarose met behulp van een tang en een breed getipte plastic transferpipet en monteer vervolgens opnieuw voor beeldvorming vanuit een ander perspectief.
6. Zodra de agarose is ingesteld, dek af met 2 - 3 ml E3 aangevuld met tricaine (en PTU indien nodig).
7. Beeld de embryo's in met behulp van een omgekeerde breedveld epifluorescentie, laserscanning confocale of draaiende schijf confocale microscoop. Selecteer het doel dat het meest geschikt is voor de gewenste beeldvorming. Gebruik voor een gezichtsveld van een heel embryo een 4x-doelstelling. Selecteer een hogere vergroting, zoals een 20x-objectief, om een specifiek weefsel in beeld te brengen
   OPMERKING: Als u een rechtopstaande microscoop gebruikt, monteert u LMP-agarose (vergelijkbaar met hierboven) op een glazen afdekstrip. Keer de glasbekleding om op een glazen microscoopschuif met een ring van vacuümvet gevuld met dezelfde E3-tricaine-PTU.
8. Verwerk verkregen afbeeldingen met behulp van gratis softwarepakketten voor beeldanalyse, zoals NIH Image J/FIJI.
   OPMERKING: Tel celnummers en kwantificeer dynamiek zoals celmigratie en celdeling met behulp van segmentatie- en trackingalgoritmen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMP agarose (Ultrapure LMP agarose)	Invitrogen	16520100
Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S)	Western Chemical Inc	MS 222
Glass-bottom 6-well plates used for imaging	MatTek	P06G1.5-20-F
10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor)	Novatech International	F37898-0000