أجار تصاعد: طريقة أساسية لتركيب الأجنة حمار وحشي لايف للتصوير على المدى الطويل

Overview

يصف هذا الفيديو تعليمات خطوة بخطوة حول تركيب أجنة حمار وحشي حية على 6 لوحة بئر باستخدام agarose منخفض الذوبان. كما يوفر عملية الحصول على صور الأجنة الحية وتحليلها باستخدام البرمجيات.

Protocol

1. إعداد المجهر ، الحصول على الصورة ، والمعالجة والتحليل

1. إعداد 0.8٪ نقطة انصهار منخفضة (LMP) agarose: إضافة 0.8 غرام LMP agarose إلى 100 مل E3 والحرارة حتى يذوب تماما. في حين الساخنة، aliquot 1 مل من Agarose LMP في أنابيب ميكروفوج 1.5 مل في كتلة التدفئة 37 درجة مئوية. سيبقى Agarose LMP منصهرا عند 37 درجة مئوية. إضافة 40 ميكرولتر من 4 ملغ / مل (25x)، درجة الحموضة 7.0 tricaine إلى كل 1 مل aliquot من LMP agarose في 37 درجة مئوية ملاحظة: إذا كان العمل مع سلالة مصطبغة، إضافة 20 ميكروغرام من 0.15٪ (50x) PTU إلى كل 1ml aliquot.
   1. تخزين Agarose LMP المتبقية لعدة أشهر في أنابيب مختومة 50 مل في 4 درجة مئوية.
2. تخدير الأجنة البارابيوتيكية التي سيتم تصويرها عن طريق إضافة 1 مل من 4 ملغم / مل (25x) ، pH 7.0 tricaine إلى 25 مل من E3 التي توجد فيها الأجنة بالفعل.
3. دوامة بلطف الطبق بحيث الأجنة سوف تجمع في الوسط. ثم، وذلك باستخدام ماصة نقل البلاستيك واسعة الرؤوس، ووضع الأجنة في أقل قدر ممكن من السائل. بدوره ماصة تستقيم وترتد بلطف الأجنة بحيث تستقر في الجزء السفلي جدا من ماصة.
   1. مع الأجنة في الجزء السفلي من ماصة، ونقلها إلى 1 مل aliquot من Agarose LMP عن طريق لمس طفيفة غيض ماصة إلى سطح الآغروز. تجنب نقل السائل الزائد لأن هذا سوف يخفف من الآغاروز.
4. بعد طرد السائل الزائد من المصصة ، استخدم المصصة لخلط الأجنة برفق داخل الآجروز ، ثم استخدم المصة لنقل جميع الآجروز والأجنة إلى بئر قاع زجاجي (رقم 1.5 coverslip) ، لوحة 6-well.
   ملاحظة: تأكد من التخلص من ماصة بعد نقل الأجنة إلى لوحة التصوير. سيتم تعيين agarose المتبقية داخل ماصة، مما يجعلها غير فعالة لمزيد من الاستخدام. بدلا من ذلك، استخدم ماصة جديدة في كل مرة.
5. تحت مجسمة، استخدم تلميح ماصة هلام التحميل ثابتة على نهاية إبرة إغاظة الخشب التعامل معها لوضع الأجنة أسفل نحو الزجاج الغطاء (لضمان أنها على مسافة العمل من الهدف المجهر) وفي الاتجاه المطلوب للتصوير.
   ملاحظة: إعادة وضع بشكل مستمر حتى agarose قد وضعت تماما. الحرص على تركيب الأجنة البارابيوتيك وفقا للجنين الذي من الزوج هو أن تكون مصورة. نظرا للتوجه العشوائي للأجنة الملتصقة ، قد يكون من الصعب بالنسبة لبعض الأزواج تصوير كلا الجنينين. في هذا السيناريو، استرداد الأجنة من agarose باستخدام ملقط وماصة نقل البلاستيك واسعة الرؤوس ومن ثم إعادة تحميل للتصوير من منظور مختلف.
6. مرة واحدة وقد وضعت agarose، وتغطية مع 2 -3 مل من E3 تستكمل مع tricaine (وPTU إذا لزم الأمر).
7. صورة الأجنة باستخدام مقلوب واسع المجال epi-fluorescence، ليزر المسح confocal، أو الغزل المجهر confocal القرص. حدد الهدف الأنسب للتصوير المطلوب. لحقل رؤية جنين كامل، استخدم هدف 4x. حدد تكبيرا أعلى، مثل هدف 20x، لتصوير نسيج معين
   ملاحظة: إذا كنت تستخدم المجهر تستقيم، جبل في Agarose LMP (على غرار أعلاه) على زلة غطاء زجاجي. عكس غطاء الزجاج على شريحة المجهر الزجاجي الذي يحتوي على حلقة من الشحوم فراغ مليئة نفس E3-tricaine-PTU.
8. معالجة الصور المكتسبة باستخدام حزم برامج تحليل الصور المجانية مثل NIH Image J/FIJI.
   ملاحظة: عد أرقام الخلايا وتحديد ديناميات مثل هجرة الخلايا وتقسيم الخلايا باستخدام تجزئة وتتبع الخوارزميات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMP agarose (Ultrapure LMP agarose)	Invitrogen	16520100
Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S)	Western Chemical Inc	MS 222
Glass-bottom 6-well plates used for imaging	MatTek	P06G1.5-20-F
10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor)	Novatech International	F37898-0000