在激活人类细胞中的基因表达的动态检测组蛋白修饰染色质免疫沉淀（ChIP）
Summary
本协议描述了如何染色质免疫沉淀（ChIP）是用来研究的动态改变，调节信号转导通路诱导转录的染色质模板。
Abstract
在应对各种胞外配体时，STAT（信号转导和转录激活因子）转录因子迅速招募来，他们是由在一个单一的酪氨酸残基 1的磷酸化激活的细胞表面受体在细胞质中的潜伏状态。然后，他们二聚体，并转运到细胞核驱动的靶基因的转录，影响生长，分化，动态平衡和免疫反应。毫不奇怪，因为他们在正常细胞过程中的广泛参与，STAT的功能失调导致人类疾病， 特别是2和3的癌症自身免疫性疾病。
它是公认的，是通过改变转录调节染色质模板 4,5 。这些变化包括ATP依赖的复合物，以及共价组蛋白修饰和DNA甲基化6的活动。由于基因表达激活的STAT是迅速而短暂的，它需要在STAT相关的基因位点的调节染色质模板的具体机制。要定义这些机制中，我们描述的组蛋白修饰和酶活动产生响应STAT信号的基因位点。此协议介绍，STAT信号激活基因表达染色的研究提供宝贵的一个方法，是染色质免疫沉淀。
Protocol
规划前一天，一个芯片实验计划，使足够数量的，应该是培养细胞。假设每个芯片检测将需要〜1-1.5 × 10 7细胞。始终做负球蛋白（IgG）和积极的（潘组蛋白抗体）控制和重复实验。 提示 -对于2FTGH细胞，每个芯片的检测要求在80％汇合约15 cm组织培养皿中。 第1部分：准备染色质和执行系统取出培养基，诱导细胞20毫升10％的…
Discussion
芯片协议概述已成功地应用于实验室检测超过20种不同的组蛋白修饰。此外，我们有特点的转录因子的入住变化，组蛋白修饰酶，蛋白质识别组蛋白修饰和RNA聚合酶II的转录机器，几个干扰素γ诱导的基因。我们也使用的过程，刻画在一个癌症干细胞的分化10组蛋白修饰的变化。
芯片的数据的质量最终取决于所使用的抗体的有效性和抗体之间有很大差别。故障芯片的修?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由弗吉尼亚大学，弗吉尼亚大学癌症中心和托马斯F和凯特米勒Jeffress纪念信托基金的支持。我们感谢詹姆斯E.达内尔实验室（美国洛克菲勒大学的）罗伯特罗斯实验室（Fordham大学）细胞株。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 37% Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | ||
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros | AC32715-5000 | ||
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche | 1836153 | ||
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | ||
| DMEM | Hyclone | SH30243 | ||
| DTT | Sigma | D0632 | ||
| EDTA | Fisher | BP118-500 | ||
| Ethanol | Pharmco | zp1110EP | ||
| Glycine | Roche | 100149 | ||
| Glycogen | Roche | 901393 | ||
| HEPES | Sigma | H3784 | ||
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | ||
| IgG | Jackson Immunoresearch |
109-005-003 |
||
| KCl | MP Biologicals | |||
| LiCl | Sigma | L4408 | ||
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ||
| Sodium Acetate | Fisher | BP333-500 | ||
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher | BP349-100 | ||
| NaCl | Fisher | 7647-14-5 | ||
| NP40 | US Biological | N3500 | ||
| Anti-Histone H3, CT, pan | Millipore | 07-690 | ||
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher | 108-95-2 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Fisher | 7647-14-5 | ||
| PMSF | EMD | 50-230-0316 | ||
| Proteinase K | 5-Prime | 2500140 | ||
| RNAse A | 5-Prime | 2500130 | ||
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | Millipore | 16-157 | ||
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | Millipore | 16-201 | ||
| SDS | Fisher | BP166-500 | ||
| Tris-Cl | Sigma | T5941 | ||
| Triton X-100 | Acros | 327372500 | ||
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | ||
| Anti-STAT1 | Santa Cruz | sc-345X | ||
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz | sc-899 |
References
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Tags
Chromatin ImmunoprecipitationChIPHistone ModificationActivated Gene ExpressionHuman CellsSTAT Transcription FactorsExtracellular LigandsPhosphorylationTyrosine ResidueNucleusTarget GenesGrowthDifferentiationHomeostasisImmune ResponseDysregulationHuman DiseaseCancersAutoimmune DiseasesChromatin TemplateATP-dependent ComplexesCovalent Histone ModificationsDNA Methylation
Cite This Article
Buro, L. J., Shah, S., Henriksen, M. A. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells. J. Vis. Exp. (41), e2053, doi:10.3791/2053 (2010).