Хроматин Иммунопреципитация (чип) с Пробирной Динамический гистонов Внесение изменений в Активированный экспрессии генов в клетках человека
Summary
Этот протокол описывает, как хроматин иммунопреципитации (чип) используется для изучения динамических изменений хроматина шаблон, который регулирует транскрипцию индуцированных пути передачи сигнала.
Abstract
В ответ на различные внеклеточные лиганды, STAT (преобразователь сигнала и активатор транскрипции) транскрипционные факторы быстро набираются из своего латентного состояния в цитоплазму, чтобы рецепторами клеточной поверхности, где они приводятся в действие фосфорилирования в одной остаток тирозина 1. Затем они димеризуются и транслокации в ядро для управления транскрипцию генов-мишеней, влияющих на рост, дифференцировку, гомеостаза и иммунного ответа. Не удивительно, учитывая их широкое вовлечение в нормальных клеточных процессов, нарушение регуляции функции STAT способствует болезни человека, в частности, рака 2 и аутоиммунных заболеваний 3.
Хорошо известно, что транскрипции регулируется изменений хроматина шаблон 4,5. Эти изменения включают деятельность АТФ-зависимых комплексов, а также ковалентные модификации гистонов и метилирования ДНК 6. Потому что СТАТ активации экспрессии генов является одновременно быстрый и преходящее, она требует конкретных механизмов для модуляции хроматина шаблон на STAT-зависимых локусы генов. Чтобы определить эти механизмы, мы характеризуем модификации гистонов и ферментативных активностей, которые их в генных локусов, которые отвечают на STAT сигнализации. Этот протокол описывает хроматин иммунопреципитации, метод, который является ценным для изучения СТАТ сигнализации с хроматином в активированных экспрессии генов.
Protocol
Discussion
ChIP протоколе изложены успешно используется в лаборатории для анализа более чем двадцати различных модификаций гистонов. Кроме того, мы охарактеризовали изменения в размещении транскрипционных факторов, гистон-модифицирующие ферменты, белки, которые признают модификации гистонов и ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа проводится при поддержке Университета Вирджинии, Университета штата Вирджиния онкологический центр и Томас Ф. и Кейт Миллер Джеффресс Мемориал Trust. Мы благодарим Джеймс Э. Дарнелл Lab (Rockefeller University) Роберт Росс Lab (Fordham University) для клеточных линий.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 37% Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | ||
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros | AC32715-5000 | ||
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche | 1836153 | ||
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | ||
| DMEM | Hyclone | SH30243 | ||
| DTT | Sigma | D0632 | ||
| EDTA | Fisher | BP118-500 | ||
| Ethanol | Pharmco | zp1110EP | ||
| Glycine | Roche | 100149 | ||
| Glycogen | Roche | 901393 | ||
| HEPES | Sigma | H3784 | ||
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | ||
| IgG | Jackson Immunoresearch |
109-005-003 |
||
| KCl | MP Biologicals | |||
| LiCl | Sigma | L4408 | ||
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ||
| Sodium Acetate | Fisher | BP333-500 | ||
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher | BP349-100 | ||
| NaCl | Fisher | 7647-14-5 | ||
| NP40 | US Biological | N3500 | ||
| Anti-Histone H3, CT, pan | Millipore | 07-690 | ||
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher | 108-95-2 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Fisher | 7647-14-5 | ||
| PMSF | EMD | 50-230-0316 | ||
| Proteinase K | 5-Prime | 2500140 | ||
| RNAse A | 5-Prime | 2500130 | ||
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | Millipore | 16-157 | ||
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | Millipore | 16-201 | ||
| SDS | Fisher | BP166-500 | ||
| Tris-Cl | Sigma | T5941 | ||
| Triton X-100 | Acros | 327372500 | ||
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | ||
| Anti-STAT1 | Santa Cruz | sc-345X | ||
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz | sc-899 |
References
- Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
- Bromberg, J., Darnell, J. E. The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function. Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).
- Hu, X., Ivashkiv, L. B. Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases. Immunity. 31, 539-550 (2009).
- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
- Kouzarides, T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).
- Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).
- Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. Activities of IRF-1. J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).
- Ross, R. A., Spengler, B. A. Human neuroblastoma stem cells. Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).
