Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) zur Assay Dynamische Histonmodifikationen in Activated Gene Expression in menschlichen Zellen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) verwendet wird, um den dynamischen Veränderungen der Chromatin-Vorlage, die Transkription von einem Signaltransduktionsweg induziert regulieren zu studieren.
Abstract
In Reaktion auf eine Vielzahl von extrazellulären Liganden, die STAT (Signal Transducer und Aktivator der Transkription) Transkriptionsfaktoren werden schnell von ihren latenten Zustand im Zytoplasma an Zelloberflächenrezeptoren, wo sie durch Phosphorylierung an einem Tyrosin-Rest 1 aktiviert werden rekrutiert. Dann dimerisieren und in den Zellkern transloziert, um die Transkription von Zielgenen fahren, die sich auf Wachstum, Differenzierung, Homöostase und der Immunantwort. Es überrascht nicht, angesichts ihrer weit verbreiteten Einbindung in normale Zelle Prozesse trägt Dysregulation der STAT-Funktion, um menschliche Krankheiten, insbesondere Krebs 2 und autoimmune Krankheiten 3.
Es ist bekannt, dass die Transkription von Änderungen ist es, die Chromatin-Template 4,5 geregelt. Diese Veränderungen umfassen die Aktivitäten von ATP-abhängigen Komplexen, sowie kovalenten Histon-Modifikationen und DNA-Methylierung 6. Da STAT Aktivierung der Genexpression ist schnell und transient, bedarf es spezifische Mechanismen für die Modulation der Chromatin-Template an STAT-abhängigen Gen-Loci. So definieren Sie diese Mechanismen charakterisieren wir die Histon-Modifikationen und die enzymatischen Aktivitäten, die sie an Genorte, die STAT-Signalisierung reagieren zu generieren. Dieses Protokoll beschreibt Chromatinimmunpräzipitation, eine Methode, die wertvoll für das Studium der STAT-Signalisierung an Chromatin in aktiviert die Genexpression.
Protocol
Discussion
Die ChIP-Protokoll beschrieben wurde erfolgreich im Labor zum Testen mehr als zwanzig verschiedenen Histon-Modifikationen eingesetzt. Darüber hinaus haben wir Änderungen in der Belegung von Transkriptionsfaktoren charakterisiert, Histon-modifizierende Enzyme, Proteine, die Histon-Modifikationen und der RNA Polymerase II Transkription Maschinen zu erkennen, an mehreren IFN-γ induzierten Genen. Wir haben auch das Verfahren verwendet werden, um Veränderungen in Histon-Modifikationen während der Differenzierung von Kre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird von der University of Virginia, der University of Virginia Cancer Center und The Thomas F. und Kate Miller Jeffress Memorial Trust unterstützt. Wir danken den James E. Darnell Lab (Rockefeller University) der Robert Ross Lab (Fordham University) für die Zell-Linien.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 37% Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | ||
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros | AC32715-5000 | ||
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche | 1836153 | ||
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | ||
| DMEM | Hyclone | SH30243 | ||
| DTT | Sigma | D0632 | ||
| EDTA | Fisher | BP118-500 | ||
| Ethanol | Pharmco | zp1110EP | ||
| Glycine | Roche | 100149 | ||
| Glycogen | Roche | 901393 | ||
| HEPES | Sigma | H3784 | ||
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | ||
| IgG | Jackson Immunoresearch |
109-005-003 |
||
| KCl | MP Biologicals | |||
| LiCl | Sigma | L4408 | ||
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ||
| Sodium Acetate | Fisher | BP333-500 | ||
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher | BP349-100 | ||
| NaCl | Fisher | 7647-14-5 | ||
| NP40 | US Biological | N3500 | ||
| Anti-Histone H3, CT, pan | Millipore | 07-690 | ||
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher | 108-95-2 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Fisher | 7647-14-5 | ||
| PMSF | EMD | 50-230-0316 | ||
| Proteinase K | 5-Prime | 2500140 | ||
| RNAse A | 5-Prime | 2500130 | ||
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | Millipore | 16-157 | ||
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | Millipore | 16-201 | ||
| SDS | Fisher | BP166-500 | ||
| Tris-Cl | Sigma | T5941 | ||
| Triton X-100 | Acros | 327372500 | ||
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | ||
| Anti-STAT1 | Santa Cruz | sc-345X | ||
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz | sc-899 |
References
- Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
- Bromberg, J., Darnell, J. E. The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function. Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).
- Hu, X., Ivashkiv, L. B. Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases. Immunity. 31, 539-550 (2009).
- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
- Kouzarides, T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).
- Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).
- Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. Activities of IRF-1. J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).
- Ross, R. A., Spengler, B. A. Human neuroblastoma stem cells. Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).
