الخلايا الجذعية المحفزة المتنامي في تعليق تفرق في الهيئات مضغي الشكل (EBS). نحن هنا لشرح كيفية الحصول على جودة عالية cryosections EB مفيدة لدراسة الجوانب الخلوية والجزيئية لمرحلة التطور الجنيني ، مع الحفاظ على مؤسساتهم والمجاميع.
Abstract
الجذعية الجنينية (ES) الخلايا هي الخلايا المحفزة المستمدة من كتلة الخلايا الداخلية للأجنة في مرحلة الكيسة أوائل الثدييات 1. مرحلة حاسمة في التفريق بين الخلايا وفاق هو تشكيل هيئات مضغي الشكل (EBS) المجاميع 2 ، 3. ويستند تشكيل المجلس التنفيذي على تجميع عفوية عندما يتم استزراع خلايا ES في لوحات غير ملتصقة. يلخص EB ثلاثي الأبعاد جوانب كثيرة من الثدييات الجنيني المبكر ، والتفريق في الطبقات الجرثومية الثلاث : الأديم الظاهر ، الأديم المتوسط والأديم الباطن 4.
وتستخدم على نطاق واسع والمناعي في الموقع التهجين التقنيات للكشف عن الهدف والبروتينات الموجودة في خلايا مرنا من قسم النسيج 5 ، 6 ، 7. نقدم هنا تقنية بسيطة لتوليد cryosections عالية الجودة للهيئات مضغي الشكل. هذا النهج يعتمد على التوجه المكاني لتضمين EB في أكتوبر تليها تقنية cryosection. يمكن أن يتعرض المقاطع مما أدى إلى طائفة واسعة من الإجراءات التحليلية من أجل تميز السكان من الخلايا التي تحتوي على بروتينات معينة ، أو الحمض النووي الريبي DNA. في هذا المعنى ، وإعداد cryosections EB (10μm) هي الأدوات الأساسية للتحليل تلطيخ الأنسجة (مثلا Hematoxilin ويوزين ، دابي) ، المناعي (مثل Oct4 ، nestin) أو التهجين في الموقع. هذه التقنية يمكن أن يساعد أيضا في فهم جوانب من مرحلة التطور الجنيني فيما يتعلق بالحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد كروية EBS.
Protocol
1. التثبيت والحفظ بالتبريد ومثقف الخلايا الجذعية المحفزة على الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEF) المعطل مع C mitomycin والمحافظة عليها في DMEM/F12 تستكمل مع خروج المغلوب استبدال 20 ٪ المصل (KSR) و8ng / مل من عامل نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل ال…
Discussion
الأسلوب الموصوفة هنا يوفر وسيلة سهلة لمتابعة بروتوكول للحصول على أبواب ثابتة PFA ناظم البرد رقيقة من الهيئات مضغي الشكل مفيدة للالمناعي والمقايسات التهجين الموقع. وcryosections الناتجة تسمح بدراسة الجوانب الخلوية والجزيئية للخلايا الجذعية الجنينية البشرية الت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل قرينتها دي أمبارو a Pesquisa تفعل استادو دو ريو دي جانيرو (FAPERJ) ، ناسيونال دي Conselho Desenvolvimento Científico تكنولوجيكو ه (CNPq) والمعهد الوطني للبحوث والتكنولوجيا Ciência ه (INCTC). ونحن ممتنون لبرونا S. M. بولسن وألين فرنانديز للصور EB.
Gomes, I. C., Acquarone, M., Maciel, R. d. M., Erlich, R. B., Rehen, S. K. Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (46), e2344, doi:10.3791/2344 (2010).