Analyse de cellules souches pluripotentes en utilisant cryocoupes de corps embryoïdes
Summary
Les cellules souches pluripotentes croissante en suspension se différencier en corps embryoïdes (EBS). Ici, nous montrons comment obtenir de haute qualité cryocoupes EB utile pour étudier les aspects cellulaires et moléculaires de l'embryogenèse, tout en préservant leur organisation en tant que granulats.
Abstract
Les cellules souches embryonnaires (ES) sont des cellules pluripotentes dérivées de la masse cellulaire interne de blastocyste-stade précoce des embryons de mammifères 1. Une étape cruciale dans la différenciation des cellules ES est la formation de corps embryoïdes (EB) des agrégats 2, 3. La formation EB est basée sur l'agrégation spontanée lorsque les cellules ES sont cultivées en plaques non adhérentes. Récapitule EB tridimensionnelle de nombreux aspects de l'embryogenèse chez les mammifères début et se différencient en trois feuillets embryonnaires: ectoderme, mésoderme et endoderme 4.
Immunofluorescence et hybridation in situ sont largement utilisés des techniques pour la détection des protéines cibles et de l'ARNm dans les cellules d'une section de 5 tissus, 6, 7. Nous présentons ici une technique simple pour générer cryocoupes haute qualité de corps embryoïdes. Cette approche repose sur l'orientation spatiale d'intégrer EB en OCT suivie par la technique cryosection. Les sections qui en résulte peut être soumis à une grande variété de procédures analytiques afin de caractériser les populations de cellules contenant certaines protéines, ARN ou ADN. En ce sens, la préparation de cryocoupes EB (10 microns) sont des outils essentiels pour l'analyse histologique coloration (par exemple hématoxiline et l'éosine, DAPI), l'immunofluorescence (par exemple Oct4, nestine) ou l'hybridation in situ. Cette technique peut aussi aider à comprendre les aspects de l'embryogenèse à l'égard du maintien de la structure tri-dimensionnelle sphériques d'EBS.
Protocol
Discussion
La méthode décrite ici fournit un facile à suivre le protocole pour obtenir PFA fixes sections de cryostat mince de corps embryoïdes utiles pour l'immunofluorescence et dans des essais d'hybridation in situ. Le cryocoupes résultant permettre l'étude des aspects cellulaires et moléculaires de cellules souches humaines différenciation embryonnaire, tout en préservant leur structure et leur organisation en tant que granulats.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fundação de Amparo une Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Tecnológico e Científico (CNPq) et l'Instituto Nacional de Ciencia e Tecnologia (INCTC). Nous sommes reconnaissants à S. Paulsen Bruna et Aline M. Fernandes pour les images EB.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | TPP | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
References
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