El análisis de las células madre pluripotentes utilizando criosecciones de cuerpos embrioides
Summary
Las células madre pluripotenciales de crecimiento en suspensión se diferencian en cuerpos embrioides (EBS). Aquí se demuestra cómo obtener alta calidad cryosections EB útil para el estudio de los aspectos celulares y moleculares de la embriogénesis, mientras que la preservación de su organización en forma de agregados.
Abstract
Madre embrionarias (ES) son células pluripotentes derivadas de la masa celular interna del blastocisto en fase inicial, los embriones de mamíferos 1. Una etapa crucial en la diferenciación de células madre embrionarias es la formación de cuerpos embrioides (EBS) agregados 2, 3. La formación de EB se basa en la agregación espontánea cuando las células ES se cultivaron en placas no adherente. Tridimensional recapitula EB muchos aspectos de la embriogénesis temprana de mamíferos y se diferencian en las tres capas germinales: ectodermo, mesodermo y endodermo 4.
Inmunofluorescencia e hibridación in situ se utilizan mucho las técnicas para la detección de proteínas diana y el ARNm presente en las células de una sección de tejido 5, 6, 7. Aquí presentamos una técnica sencilla para generar cryosections alta calidad de los cuerpos embrioides. Este enfoque se basa en la orientación espacial de la incorporación de EB en octubre seguido por la técnica cryosection. Las secciones resultantes pueden ser objeto de una amplia variedad de procedimientos analíticos para caracterizar las poblaciones de células que contienen ciertas proteínas, ADN o ARN. En este sentido, la preparación de cryosections EB (10μm) son herramientas esenciales para el análisis de la tinción histológica (por ejemplo, hematoxilina y eosina, DAPI), inmunofluorescencia indirecta (por ejemplo, Oct4, nestin) o hibridación in situ. Esta técnica también puede ayudar a comprender aspectos de la embriogénesis en lo que respecta al mantenimiento de la estructura esférica tridimensional de EBS.
Protocol
Discussion
El método descrito aquí proporciona una forma fácil de seguir el protocolo para obtener PFA fijo secciones de criostato delgada de cuerpos embrioides útil para inmunofluorescencia y en los ensayos de hibridación in situ. El cryosections resultante permitirá el estudio de aspectos celulares y moleculares de la madre de embriones humanos diferenciación de células, mientras que preserva su estructura y organización de los agregados.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Amparo un Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) y el Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTC). Estamos muy agradecidos a Bruna S. Paulsen y Aline M. Fernandes para las imágenes EB.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | TPP | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
References
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-117 (1998).
- Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, 88-95 (2000).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).
- Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells. Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).
- Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Mol Cells. 24, 76-82 (2007).
- Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).
- Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimarães, M. Z., Rehen, S. K. Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies. Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).
- Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating. Histochemistry. 77, 275-279 (1983).
- Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats. Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).
