Dissecção da Human Elements Corpo Vítreo para Análise Proteômica

Summary

Este vídeo mostra uma técnica eficaz para diferenciar e dissecando os vários semi-transparente das estruturas do corpo humano na pós vítreos olhos mortem.

Abstract

O vítreo é uma opticamente clara, matriz extracelular de colágeno, que preenche o interior do olho e recobre a retina. ^1,2 interações anormais entre subestruturas vítreo e da retina subjacentes várias doenças vítreo-retinianas, incluindo rasgaduras da retina e descolamento, pucker macular, buraco macular, idade degeneração macular relacionada à tração vítreo, Vitreorretinopatia proliferativa, retinopatia diabética proliferativa, e vitreoretinopathies herdada. ^1,2 A composição molecular do vítreo subestruturas não é conhecido. Desde que o corpo vítreo é transparente com acesso cirúrgico limitado, tem sido difícil de estudar suas subestruturas no nível molecular. Desenvolvemos um método para separar e preservar estes tecidos para análise proteômica e bioquímica. A técnica de dissecção neste vídeo experimental mostra como isolar base vítrea, hialóide anterior, o núcleo vítreo, e no córtex vítreo dos olhos pós-morte humana. Unidimensional SDS-PAGE análises de cada componente do vítreo mostrou que a nossa técnica de dissecção resultou em quatro perfis de proteína única correspondente a cada subestrutura do corpo vítreo humano. Identificação de proteínas diferencialmente compartimentada irá revelar as moléculas candidato subjacente várias doenças vítreo-retinianas.

Protocol

1. A dissecção do segmento anterior. A córnea é removida por primeiro fazer uma incisão no limbo dentro da câmara anterior utilizando uma lâmina de 15 ° (Figura 1). Em seguida, uma lâmina curvada de córnea escleral-tesoura é inserida dentro da câmara anterior. Circunferencial cortes são feitos na córnea, apenas anterior ao limbo. 0,12 Colibri pinças e tesoura Westcott são usados ​​para cortar a íris circunferencialmente anterior ao corpo ciliar. O núcleo da lente foi removida com fórceps 0,12 Colibri ou uma lâmina de 15 ° (supersharp) e do córtex e da cápsula com uma pinça. 2. Aspiração Central vítreo. Uma agulha 23 gauge em uma seringa de 5 cc é inserido em meados da década de vítreo (Figura 1). Aproximadamente 1 mL ou mais do núcleo vítreo é suavemente aspirado. A amostra é então colocada em um tubo de microcentrífuga e depois em nitrogênio líquido. 3. Dissecação hialóide anterior. A hialóide anterior é visto como um anel semi-transparente, ajustando a luz incidente de um microscópio de luz ganso pescoço. Aspiração anteriores do núcleo vítreo se separa da hialóide anterior de outras estruturas para facilitar a identificação. A folha de tecido elástico é cuidadosamente puxado para longe do corpo ciliar com Colibri ou fórceps vestir-se e cortou com uma tesoura Vannas. Esta manobra é repetida. A amostra é então colocada em um tubo de microcentrífuga e depois em nitrogênio líquido. 4. Dissecção da Base vítreo. Usando 0,12 fórceps para estabilizar a taça do olho, uma tesoura Westcott são usados ​​para "flor" o olho fazendo quatro igualmente espaçados de aliviar o stress cortes do corpo ciliar em direção à cabeça do nervo óptico. A pars plicata do corpo ciliar (Figura 2) é removida de cada um dos quadrantes usando uma tesoura Westcott. A base vítrea é, então, agarrou em ambos os lados da ora serrata com uma pinça sobre o pars plana e retina (Figura 2). Tração contínua sobre a base vítrea é aplicada com a pinça. Corte sequencial com tesoura Westcott extrai um tecido semi-transparente com um "colar de pérolas" aparência como é extirpado. A amostra é então colocada em um tubo de microcentrífuga e depois em nitrogênio líquido. 5. Remoção Cortex vítreo. A pars plana é retirado de cada um dos quadrantes com tesoura Westcott cortando o folheto aproximadamente 3 mm posterior à ora serrata (Figura 2). Entre os folhetos de tecido, o córtex do vítreo é visualizado como um filme semi transparente. O filme elástico ou é apreendido com 0,12 forceps ou detidos pela adesão a uma esponja Weck-Cel cirúrgico. O córtex vítreo é, então, afastou-se da retina e retirado com tesoura Westcott (Figura 1). A amostra é colocada em um tubo de microcentrífuga e depois em nitrogênio líquido. Todas as amostras são armazenadas a -80 ° C até utilizados para a experimentação. 6. Resultados representante Amostras de tecido pode ser processado por uma variedade de métodos para experimentos específicos. No nosso caso, as amostras foram submetidas a análise de proteínas por SDS-PAGE (Figura 3). Figura 1. Transversal visão do olho humano representando subestruturas diferentes do corpo vítreo. O vítreo mais anterior é uma fina camada de colágeno chamado de hialóide anterior. O núcleo vítreo compreende toda a região central do corpo vítreo. Esta parte do vítreo é mais aquosa em contraste com a base vítrea, que é viscoso o suficiente para ser captado por uma pinça e está firmemente ligado ao corpo ciliar e retina subjacente. Abrangendo o núcleo vítreo é um shell muito finas de colágeno chamada córtex vítreo. Figura 2. Anatomia base vítrea. A base do vítreo é uma infra-estrutura semi-transparente do corpo vítreo localizado junto à ora serrata (setas brancas), que é a linha divisória que separa o corpo ciliar e retina. A borda anterior da base do vítreo se estende sobre a pars plana (linha branca) do corpo ciliar. A borda posterior da base vítrea estende 2-3 mm posterior à ora serrata (traço branco). Para extirpar a base do vítreo, uma pinça são usados ​​para captar o tecido e puxe-o para longe do corpo ciliar e retina subjacente. Uma vez elevado, tesoura Westcott são usados ​​para cortar ao longo da base. Figura 3. Unidimensional SDS-PAGE de elementos do corpo vítreo. Concentrações de proteína total para a hialóide anterior, base vítrea, vitreous núcleo e córtex vítreo foram 11,24, 20,1, 16,61, 14,24 mg / mL, respectivamente. Eletroforese em gel foi realizada em 200 kV por 45 minutos, corados com Flamingo (Bio-Rad), e visualizados através de um VersaDoc Imaging System (Bio-Rad). Os perfis para os diferentes tecidos mostrar várias bandas similares, indicando quer conservada ou cross-contaminação proteínas, bem como as bandas originais (asterisco), indicando proteínas diferencialmente localizada.

Discussion

O corpo vítreo é um gel semi-transparente, cuja composição molecular é mal compreendida, especialmente no nível de suas subestruturas: a base do vítreo, núcleo, córtex, e hialóide anterior. O núcleo vítreo contém colágenos II, V, IX e XI, juntamente com proteoglicanos sulfato de condroitina, sulfato de heparan proteoglicanos, e. Hyaluronan ^1,2 biomarcadores de proteína no núcleo vítreo têm sido associadas a doenças como a retinopatia diabética. ^3-5 Como estas proteínas são diferencialmente expressos em cada uma das subestruturas, e em muitos casos, as identidades de proteínas específicas, não são conhecidos. Estas informações podem dar uma visão sobre a origem de proteínas associadas com certas doenças vítreo-retinianas e ajudar a futuras terapias-alvo. Embora o ideal intervalo post mortem para dissecção dos tecidos não foi determinado, a degradação de proteínas pode afetar experimentos a jusante. Por exemplo, imuno-histoquímica é afetado nos olhos de 12 horas pós-morte e algumas atividades de enzima específica pode ser reduzida dentro de algumas horas (observação não publicada). Todos os tecidos no presente estudo foram coletados entre 2 e 8 horas de morte, sem mudanças significativas na expressão da proteína ou da aptidão para analsyis proteômica. O método de congelamento de nitrogênio líquido de preservação é escolhido em detrimento de fixação para evitar pequenas mudanças na estrutura da proteína causada por fixador reticulação, que tem sido demonstrada em outros tecidos por LC-MS/MS. ⁶ estudos Proteômica dependerá da capacidade de precisão dissecar os diferentes compartimentos do vítreo, como demonstrado nesta experiência de vídeo. Temos validou a técnica de dissecção utilizando 1-dimensional SDS-PAGE. Como nossos resultados sugerem, existem proteínas diferencialmente expressos no corpo várias subestruturas vítreo. A identificação dessas proteínas irá fornecer uma compreensão mais detalhada de compartimentalização vítreo.

Materials

Name	Company	Catalog Number
0.12 forceps	Storz Ophthalmics	E1502
5-cc syringe	Becton-Dickinson	309603
Straight Dressing Forceps With Serrations	Storz Ophthalmics	E1400
23 gauge needle	Becton-Dickinson	305145
Colibri forceps	Storz Ophthalmics	2/132
Castroviejo angled corneal scissors	Storz Ophthalmics	E3223
Vannas Curved Capsulotomy Scissors	Storz Ophthalmics	E3387
Weck-Cel surgical spears	Medtronic	0008680
Westcott Curved Tenotomy Scissors	Storz Ophthalmics	E3320