Um grande impedimento para análises bioquímicas dos ribossomos contendo nascente peptidil-tRNAs foi a presença de ribossomos outros nas mesmas amostras, os ribossomos não estão envolvidos na tradução da seqüência de mRNA específico que está sendo analisado. Nós desenvolvemos uma metodologia simples para purificar, exclusivamente, os ribossomos que contém a nascente peptidil-tRNA de interesse.
Recentemente, estudos estruturais e bioquímicos têm detalhada muitos dos eventos moleculares que ocorrem no ribossomo durante a inibição da síntese proteica por antibióticos e, durante a síntese de polipeptídeos nascentes. Alguns destes antibióticos, e regulamentar polipeptídeos nascentes principalmente na forma de peptidil-tRNAs, inibem ou formação da ligação peptídica ou término de tradução 1-7. Estes eventos inibitória pode parar o movimento do ribossomo, um fenômeno denominado "prisão de translação". Prisão tradução induzida por qualquer um antibiótico ou um polipeptídeo nascente foi mostrado para regular a expressão de genes envolvidos em diversas funções celulares, como crescimento celular, a resistência aos antibióticos, a translocação de proteínas e metabolismo celular 8-13. Conhecimento de como antibióticos e regulamentares polipeptídeos nascentes alterar a função do ribossomo é essencial se quisermos compreender o papel completo do ribossoma na tradução, em cada organismo.
Aqui, descrevemos uma metodologia simples que podem ser usados para purificar, exclusivamente, para análise, os ribossomos traduzindo um mRNA específico e contendo um determinado peptidil-tRNA 14. Este procedimento é baseado no isolamento seletivo de ribossomos traduzindo vinculado a um mRNA biotina-rotulados. Estes complexos de translação são separados dos ribossomos outros na mesma mistura, usando pérolas paramagnética estreptavidina (SMB) e um campo magnético (MF). MRNAs biotina-rotulados são sintetizados por ensaios de run-off de transcrição usando como modelos de fragmentos de PCR gerado DNA que contêm promotores T7 transcricional. T7 RNA polimerase incorpora biotina-16-UMP de biotina-UTP; nas nossas condições aproximadamente dez biotina-16-UMP moléculas são incorporadas em um mRNA nt 600 com um teor UMP 25%. Estes biotina-rotulados mRNAs são então isolados, e utilizado em ensaios in vitro realizados com tradução fator de liberação de 2 (RF2) estão esgotados livre de células extratos obtidos a partir de cepas de Escherichia coli contendo o tipo selvagem ou mutante ribossomos. Ribossomos traduzindo a biotina marcada com seqüências de mRNA estão paralisadas na região códon de parada, devido à ausência da proteína RF2, que normalmente realiza encerramento de tradução. Ribossomos parado contendo o recém-sintetizado peptidil-tRNA são isolados e removidos a partir de reações de tradução usando SMB e um MF. Estas contas só ligar biotina contendo mensagens.
Os isolados, complexos de translação, pode ser usado para analisar as características estruturais e funcionais do tipo selvagem ou mutante componentes ribossomal, ou peptidil-tRNA seqüências, bem como determinar a interação ribossomo com antibióticos ou outros fatores moleculares 1,14-16. Para examinar a função desses complexos isolados ribossomo, peptidil-transferase ensaios podem ser realizados na presença do antibiótico puromicina 1. Para estudar as mudanças estruturais em complexos de translação, procedimentos bem estabelecidos podem ser utilizados, tais como i) crosslinking a 14 aminoácidos específicos e / ou ii) ensaios alquilação proteção 1,14,17.
Este procedimento de isolamento descritas neste relatório é altamente reprodutível. Infelizmente, a presença de curto peptidil-tRNAs produzido a partir de seqüências de mesmo traduzido não pode ser convenientemente evitada; tais peptidil-tRNAs podem corresponder a 15-20% do material total isolada (Figura 2C). Estes contaminantes podem aumentar em concentração quando maiores concentrações de mRNA biotina-rotulados foram usadas ou quando os extratos de células livres usados são antigos ou que tenham sido re-utilizado várias vezes. Portanto, é muito importante para controlar a qualidade e concentração dos componentes da tradução em reações in vitro. Alternativamente, alta eficiência comercial reconstituído livre de células extratos estão disponíveis, que podem ser utilizados para os mesmos fins (sistema PURE) 18.
Usando este método, biotina-16-UMP é incorporado aleatoriamente ao longo do comprimento do mRNA alvo. Há uma possibilidade de que alguns ORFs contendo uridina tratos podem ter incorporado este nucleotídeo modificado em suas seqüências, afetando a sua tradução. Variável concentrações relativas de biotin-16-UTP/UTP têm de ser testados durante a síntese do mRNA, a fim de obter a tradução mais eficiente. Métodos alternativos de rotulagem biotina pode ser usado, visando o 5'-final, final mais estável do mRNAs. (I) A biotina pode ser ligado à extremidade 5'-do mRNA usando 3'-NH2ATP (3'-amino, trifosfato de 3'-desoxiadenosina) e T4 RNA ligase 19. (Ii) 5'-end biotina marcada com oligonucleotídeo pode ser ligado à extremidade 5'-do mRNA usando RNA ligase T4 bem 20. (Iii) 3'-end biotina-rotulados oligodeoxynucleotides que correspondem à seqüência complementar no final 5'-do mRNA também poderia ser usado para isolar os complexos de tradução. Estes oligodeoxynucleotides biotina marcada poderia ser anexado ao SMB antes de isolamento. Mais tarde, o SMB ligado à biotina-rotulados oligodeoxynucleotides poderia ser misturado com a mistura de reação de tradução para permitir a interação com suas seqüências de mRNA complementar. Após o isolamento, a região RNA-DNA híbrido – e na região hibridação entre o oligodeoxynucleotide biotina marcado ea seqüência de mRNA – poderiam ser degradadas com RNAse H, separando os complexos parado dos grânulos estreptavidina. Este método alternativo pode permitir que os complexos a ser empregada, no futuro, análises estruturais usando métodos de resolução mais alta.
The authors have nothing to disclose.
LRC-V. desejos de dedicar este artigo à memória do Dr. Adriel D. Johnson, um professor maravilhoso, cuja prioridade número um era sempre a educação dos estudantes. Nós sentimos sua falta, Adriel. Somos gratos a Jacqueline Moreno por sua ajuda na realização das experiências descritas neste estudo. Este estudo foi suportado por uma concessão fornecida para CY da National Science Foundation, MCB-0615390, e por fundos start-up desde a LRC-V. da Universidade do Alabama, em Huntsville.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Tris base | Sigma | 252859 | ||
Magnesium acetate | Fluka | 63049 | ||
Potassium glutamate | Sigma | G1501 | ||
Ammonium acetate | Fluka | 09688 | ||
PMSF | Sigma | P7626 | ||
Protein A sepharose 4B slurry beads | Sigma | P9424 | ||
Leupeptin inhibitor | Sigma | L9783 | ||
Taq-DNA polymerase | Stratagene | 201223 | ||
T7 Maxiprep kit | Promega | P1300 | ||
SMB | Promega | Z5482 | ||
Biotin-16-UTP | Roche | 1388908 | ||
ATP | Sigma | A7699 | ||
GTP | Sigma | G8877 | ||
PEP | Sigma | P7002 | ||
PK | Sigma | P7768 | ||
Polyethylenglycol 8000 | Fluka | 81268 | ||
Folinic acid | Fluka | 47612 | ||
Spermidine | Fluka | 85558 | ||
tRNA from E. coli | Sigma | R1753 | ||
DEPC | Sigma | D5758 | ||
Tricine | Sigma | T5816 | ||
L-amino acids | Sigma | LAA21 | ||
DTT | Fluka | 43815 | ||
magnetic separation stands | Promega | Z5342 |