Doğmakta olan peptidil-tRNAs içeren ribozomların biyokimyasal analizler için büyük bir engel, aynı örneklerde diğer ribozom varlığı olmuştur analiz edilen spesifik mRNA dizisinin çevirisinde yer almayan ribozomlar. Biz sadece ilgi doğmakta olan peptidil-tRNA içeren ribozomlar arındırmak için basit bir yöntem geliştirdi.
Son zamanlarda, yapısal ve biyokimyasal çalışmalarda birçok ribozom antibiyotikler ile protein sentezi inhibisyonu sırasında ve doğmakta olan polipeptid sentezi sırasında meydana gelen moleküler olayların detaylı var. Bazı antibiyotikler, ve çoğunlukla peptidil-tRNAs formu düzenleyici doğmakta olan polipeptidlerin, peptid bağı oluşumu veya çeviri fesih 1-7 inhibe ederler. Bu inhibitör olaylar ribozom hareketi durdurmak, bir fenomen "translasyon tutuklama" olarak nitelendirdi. Bir antibiyotik ya da olgunlaşmamış bir polipeptid ya indüklenen Çeviri tutuklanması, hücre büyümesi, antibiyotik direnci, protein translokasyon ve hücre metabolizması 8-13 gibi çeşitli hücresel fonksiyonları yer alan genlerin ifade düzenleyen gösterilmiştir. Biz her organizma çeviri ribozom tam rolü, anlamak istiyorsak, antibiyotik ve düzenleyici doğmakta olan polipeptidlerin ribozom fonksiyonu nasıl değiştirdiğini Bilgi esastır.
Burada, biz, sadece arındırmak analiz için, bu ribozom belirli bir mRNA'nın çeviri ve belirli bir peptidil-tRNA 14 içeren kullanılan basit bir metodoloji açıklanmaktadır. Bu prosedür, biotin etiketli mRNA bağlı ribozomlar tercüme selektif izolasyon dayanmaktadır. Bu translasyonel kompleksleri streptavidin paramanyetik boncuk (SMB) ve (MF) bir manyetik alan kullanarak, aynı karışımı diğer ribozom ayrılır. Biotin-etiketli mRNA'ların T7 transkripsiyonel rehberleri içeren şablonları PCR oluşturulan DNA parçaları kullanarak run-off transkripsiyon analizleri ile birleşiyor. T7 RNA polimeraz biotin UTP biotin-16-UMP içeriyor; koşullar altında yaklaşık on biotin-16-UMP moleküllerinin% 25 UMP içeriği ile 600 nt mRNA dahil edilmiştir. Bu biotin etiketli mRNA'ların sonra izole ve serbest faktör 2 (RF2) ile yapılan in vitro çeviri deneylerde kullanılan tükenmiş yabani türü veya mutant ribozom içeren Escherichia coli suşlarının elde edilen hücre özleri. Biotin etiketli mRNA dizileri çevirirken Ribozomlar, normalde çeviri fesih gerçekleştirir RF2 protein, olmaması nedeniyle, stop kodon bölgedeki sekteye uğruyor. Yeni sentezlenmiş peptidil-tRNA içeren durdu ribozomlar izole ve SMB ve MF kullanarak çeviri reaksiyonlar kaldırılır. Bu boncuklar sadece biotin içeren mesajlar bağlanır.
Izole, translasyonel kompleksleri, vahşi tip ya da mutant ribozomal bileşenleri, veya peptidil-tRNA dizilerinin yanı sıra, antibiyotik veya diğer moleküler faktörler 1,14-16 ribozom etkileşim belirleyen yapısal ve fonksiyonel özelliklerini analiz etmek için kullanılabilir. Bu izole ribozom kompleksleri fonksiyonunu incelemek için, peptidil transferaz deneyleri, antibiyotik puromycin 1 varlığında yapılabilir . Translasyonel komplekslerinin yapısal değişiklikleri incelemek için, iyi kurulmuş prosedürler belirli amino asitleri 14 ve / veya ii) alkilleme koruma deneyleri 1,14,17) i olarak, crosslinking kullanılan olabilir.
Bu raporda açıklanan Bu izolasyon prosedürü yeniden üretilebilir niteliktedir. Ne yazık ki, aynı tercüme dizileri üretilen kısa peptidil-tRNAs varlığı uygun kaçınılmalıdır; böyle peptidil-tRNAs toplam izole malzeme (Şekil 2C)% 15-20 oranında karşılık gelebilir. Bu kirleticiler, biotin etiketli mRNA yüksek konsantrasyonlarda kullanılan ya da kullanılan hücre özü, eski ya da birkaç kez tekrar edilmiştir konsantrasyon artırabilir. Bu nedenle, in vitro çeviri reaksiyonlarda bileşenleri kalite ve konsantrasyonunu kontrol etmek için çok önemlidir . Alternatif olarak, ticari yüksek verim sulandırılmış hücre özleri, aynı amaçlar (PURE sistemi) 18 için kullanılabilir mevcuttur .
Bu yöntemi kullanarak, biotin-16-UMP rastgele hedef mRNA uzunluğu boyunca kurulmuştur. Üridin yolları içeren bazı Orfs kendi çeviri etkileyen, dizileri nükleotid değiştirilmiş dahil olabilir olasılığı vardır. Biotin-16-UTP/UTP değişken, göreceli konsantrasyonların mRNA sentezi sırasında en etkili çeviri elde etmek için test edilmesi gerekir. MRNA'ların 5'-sonunda, en istikrarlı sonuna hedefleyen, biotin etiketleme alternatif yöntemler kullanılabilir. (I) Biotin, 3'-NH2ATP (3'-amino, 3'-deoksiadenozin trifosfat) ve T4 RNA ligaz 19 mRNA 5'-end eklenebilir . (Ii) 5'-biotin-etiketli oligonükleotid yanı sıra 20 T4 RNA ligaz kullanarak mRNA'nın 5'-sonuna kadar eklenebilir. (Iii) mRNA'nın 5'-sonunda tamamlayıcı dizisine karşılık 3'-ucundaki biotin etiketli oligodeoxynucleotides tercüme kompleksleri da izole etmek için kullanılır olabilir. Bu biotin etiketli oligodeoxynucleotides izolasyon önce SMB bağlı olabilir. Daha sonra onların tamamlayıcı mRNA dizileri ile etkileşime olanak çeviri reaksiyon karışımı ile SMB karışık olabilir biotin etiketli oligodeoxynucleotides bağlı. Izolasyondan sonra melez RNA-DNA bölge ve bölge biotin etiketli oligodeoxynucleotide ve mRNA dizisi arasındaki literatürde – RNAse H kullanarak bozulmuş olabilir, streptavidin boncuk durdu kompleksleri ayıran. Bu alternatif yöntem, kompleksleri, yüksek çözünürlüklü yöntemler kullanılarak geleceğe yönelik yapısal analizlerde istihdam edilmek üzere izin verebilir.
The authors have nothing to disclose.
LRC-V. Bu çalışmada, sayıları bir öncelik her zaman öğrencilerin eğitim harika bir Profesör Dr. Adriel D. Johnson bellek adamak istiyor. Biz, Adriel sizi özledim. Biz bu çalışmada açıklanan deneyler ona yardım için Jacqueline Moreno minnettarız. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı, MCB-0615390 CY sağlanan hibe tarafından desteklenen ve LRC-V verilen start-up fonları tarafından. Huntsville Alabama Üniversitesi.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Tris base | Sigma | 252859 | ||
Magnesium acetate | Fluka | 63049 | ||
Potassium glutamate | Sigma | G1501 | ||
Ammonium acetate | Fluka | 09688 | ||
PMSF | Sigma | P7626 | ||
Protein A sepharose 4B slurry beads | Sigma | P9424 | ||
Leupeptin inhibitor | Sigma | L9783 | ||
Taq-DNA polymerase | Stratagene | 201223 | ||
T7 Maxiprep kit | Promega | P1300 | ||
SMB | Promega | Z5482 | ||
Biotin-16-UTP | Roche | 1388908 | ||
ATP | Sigma | A7699 | ||
GTP | Sigma | G8877 | ||
PEP | Sigma | P7002 | ||
PK | Sigma | P7768 | ||
Polyethylenglycol 8000 | Fluka | 81268 | ||
Folinic acid | Fluka | 47612 | ||
Spermidine | Fluka | 85558 | ||
tRNA from E. coli | Sigma | R1753 | ||
DEPC | Sigma | D5758 | ||
Tricine | Sigma | T5816 | ||
L-amino acids | Sigma | LAA21 | ||
DTT | Fluka | 43815 | ||
magnetic separation stands | Promega | Z5342 |