अनुवाद कार्यात्मक और स्ट्रक्चरल विश्लेषण Peptidyl tRNAs युक्त Ribosomes के अलगाव
Summary
नवजात peptidyl – tRNAs युक्त ribosomes के जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए एक प्रमुख बाधा एक ही नमूनों में अन्य ribosomes की उपस्थिति में किया गया है ribosomes, विशिष्ट mRNA विश्लेषण किया जा रहा अनुक्रम के अनुवाद में शामिल नहीं है. हम एक सरल पद्धति विकसित की शुद्ध, विशेष रूप से, ब्याज की नवजात peptidyl-tRNA युक्त ribosomes.
Abstract
Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis by antibiotics and during nascent polypeptide synthesis. Some of these antibiotics, and regulatory nascent polypeptides mostly in the form of peptidyl-tRNAs, inhibit either peptide bond formation or translation termination1-7. These inhibitory events can stop the movement of the ribosome, a phenomenon termed “translational arrest”. Translation arrest induced by either an antibiotic or a nascent polypeptide has been shown to regulate the expression of genes involved in diverse cellular functions such as cell growth, antibiotic resistance, protein translocation and cell metabolism8-13. Knowledge of how antibiotics and regulatory nascent polypeptides alter ribosome function is essential if we are to understand the complete role of the ribosome in translation, in every organism.
Here, we describe a simple methodology that can be used to purify, exclusively, for analysis, those ribosomes translating a specific mRNA and containing a specific peptidyl-tRNA14. This procedure is based on selective isolation of translating ribosomes bound to a biotin-labeled mRNA. These translational complexes are separated from other ribosomes in the same mixture, using streptavidin paramagnetic beads (SMB) and a magnetic field (MF). Biotin-labeled mRNAs are synthesized by run-off transcription assays using as templates PCR-generated DNA fragments that contain T7 transcriptional promoters. T7 RNA polymerase incorporates biotin-16-UMP from biotin-UTP; under our conditions approximately ten biotin-16-UMP molecules are incorporated in a 600 nt mRNA with a 25% UMP content. These biotin-labeled mRNAs are then isolated, and used in in vitro translation assays performed with release factor 2 (RF2)-depleted cell-free extracts obtained from Escherichia coli strains containing wild type or mutant ribosomes. Ribosomes translating the biotin-labeled mRNA sequences are stalled at the stop codon region, due to the absence of the RF2 protein, which normally accomplishes translation termination. Stalled ribosomes containing the newly synthesized peptidyl-tRNA are isolated and removed from the translation reactions using SMB and an MF. These beads only bind biotin-containing messages.
The isolated, translational complexes, can be used to analyze the structural and functional features of wild type or mutant ribosomal components, or peptidyl-tRNA sequences, as well as determining ribosome interaction with antibiotics or other molecular factors 1,14-16. To examine the function of these isolated ribosome complexes, peptidyl-transferase assays can be performed in the presence of the antibiotic puromycin1. To study structural changes in translational complexes, well established procedures can be used, such as i) crosslinking to specific amino acids14 and/or ii) alkylation protection assays1,14,17.
Protocol
Discussion
यह अलगाव की इस रिपोर्ट में वर्णित प्रक्रिया अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. दुर्भाग्य से, एक ही अनुवादित दृश्यों से उत्पादित की उपस्थिति कम peptidyl – tRNAs सुविधा नहीं बचा जा सकता है, जैसे peptidyl – tRNAs कुल पृथक सामग्री (चित्रा 2C) की 15-20% के अनुरूप कर सकते हैं. इन contaminants एकाग्रता में वृद्धि जब बायोटिन लेबल mRNA की उच्च सांद्रता का इस्तेमाल किया गया है या किया गया है जब सेल मुक्त अर्क का प्रयोग किया जाता पुराने हैं या कई बार फिर से इस्तेमाल किया हो सकता है. इसलिए, यह बहुत महत्वपूर्ण है गुणवत्ता और इन विट्रो अनुवाद प्रतिक्रियाओं में एकाग्रता के घटकों के नियंत्रण के लिए. वैकल्पिक रूप से, वाणिज्यिक उच्च दक्षता पुनर्गठन सेल मुक्त अर्क को उपलब्ध हैं कि एक ही (शुद्ध प्रणाली) प्रयोजनों के 18 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस पद्धति का उपयोग करके, बायोटिन-16-UMP बेतरतीब ढंग से लक्ष्य mRNA की लंबाई के साथ शामिल है. वहाँ एक संभावना है कि कुछ uridine इलाकों युक्त ORFs शामिल है यह अपने दृश्यों में nucleotide संशोधित, उनके अनुवाद को प्रभावित कर सकते है. Biotin-16-UTP/UTP के परिवर्तनीय रिश्तेदार सांद्रता mRNA की संश्लेषण के दौरान परीक्षण किया जा क्रम में सबसे कुशल अनुवाद प्राप्त करने के लिए है. बायोटिन लेबलिंग के वैकल्पिक तरीकों, 5'-अंत mRNAs का सबसे स्थिर अंत लक्ष्यीकरण इस्तेमाल किया जा सकता है. (I) बायोटिन 3'-NH2ATP (3'एमिनो, 3'-deoxyadenosine triphosphate) और टी -4 आरएनए 19 ligase का उपयोग mRNA की अंत – 5'करने के लिए संलग्न किया जा सकता है. (Ii) 5'-अंत बायोटिन लेबल oligonucleotide टी -4 आरएनए ligase के रूप में 20 अच्छी तरह से उपयोग mRNA की 5'अंत करने के लिए संलग्न किया जा सकता है. (Iii) 3'अंत बायोटिन लेबल oligodeoxynucleotides जो mRNA के अंत 5'पूरक अनुक्रम के अनुरूप भी अनुवाद परिसरों को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ये बायोटिन लेबल oligodeoxynucleotides किसी से जुड़ा हो सकता अलगाव के लिए पहले. बाद में किसी बायोटिन – लेबल oligodeoxynucleotides से जुड़ी अनुवाद प्रतिक्रिया के लिए उनके पूरक mRNA दृश्यों के साथ बातचीत की अनुमति मिश्रण के साथ मिलाया जा सकता है है. अलगाव के बाद, संकर शाही सेना डीएनए क्षेत्र – क्षेत्र और बायोटिन लेबल oligodeoxynucleotide और mRNA अनुक्रम के बीच hybridizing – RNase एच का उपयोग कर अपमानित किया जा सकता है, streptavidin मोतियों से ठप परिसरों को अलग. यह वैकल्पिक पद्धति परिसरों भविष्य संरचनात्मक विश्लेषण में उच्च संकल्प तरीकों का उपयोग करने के लिए नियोजित अनुमति दे सकता है.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LRC-V. डॉ. Adriel डी. जॉनसन, एक अद्भुत प्रोफेसर जिनकी संख्या एक प्राथमिकता हमेशा छात्रों की शिक्षा की स्मृति करने के लिए इस पत्र समर्पित करना चाहती है. हम आपको याद आती है, Adriel. हम इस अध्ययन में वर्णित प्रयोगों प्रदर्शन करने में उसकी मदद के लिए जैकलिन मोरेनो के लिए आभारी हैं. इस अध्ययन में एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, MCB-0615390 से CY प्रदान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और शुरू हुआ LRC-V करने के लिए उपलब्ध कराई गई निधियों द्वारा. Huntsville में अलबामा के विश्वविद्यालय से.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tris base | Sigma | 252859 | ||
| Magnesium acetate | Fluka | 63049 | ||
| Potassium glutamate | Sigma | G1501 | ||
| Ammonium acetate | Fluka | 09688 | ||
| PMSF | Sigma | P7626 | ||
| Protein A sepharose 4B slurry beads | Sigma | P9424 | ||
| Leupeptin inhibitor | Sigma | L9783 | ||
| Taq-DNA polymerase | Stratagene | 201223 | ||
| T7 Maxiprep kit | Promega | P1300 | ||
| SMB | Promega | Z5482 | ||
| Biotin-16-UTP | Roche | 1388908 | ||
| ATP | Sigma | A7699 | ||
| GTP | Sigma | G8877 | ||
| PEP | Sigma | P7002 | ||
| PK | Sigma | P7768 | ||
| Polyethylenglycol 8000 | Fluka | 81268 | ||
| Folinic acid | Fluka | 47612 | ||
| Spermidine | Fluka | 85558 | ||
| tRNA from E. coli | Sigma | R1753 | ||
| DEPC | Sigma | D5758 | ||
| Tricine | Sigma | T5816 | ||
| L-amino acids | Sigma | LAA21 | ||
| DTT | Fluka | 43815 | ||
| magnetic separation stands | Promega | Z5342 |
References
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