Een methode voor het inbedden gistkolonies waardoor snijden voor licht-en elektronenmicroscopie. Dit protocol maakt de bepaling van de verdeling van gesporuleerde cellen en pseudohyfale cellen in kolonies die een nieuwe tool in de richting van het begrijpen van de organisatie van de celtypen in een schimmel gemeenschap.
Abstract
Patroonvorming van de verschillende celtypes in embryo's is een belangrijk mechanisme in metazoïsche ontwikkeling. Gemeenschappen van micro-organismen, zoals de koloniën en biofilms ook weer patronen van celtypen. Bijvoorbeeld, in de gist S. cerevisiae, zijn gesporuleerde cellen en pseudohyfale cellen niet uniform verdeeld in kolonies. De functionele betekenis van patronen en de moleculaire mechanismen die deze patronen ten grondslag liggen zijn nog slecht begrepen.
Een van de uitdagingen met betrekking tot de onderzoeken van patronen van celtypen in schimmelkolonies is dat in tegenstelling tot metazoïsche weefsel, cellen in kolonies relatief zwak aan elkaar gehecht. In het bijzonder, hebben schimmelkolonies bevat niet dezelfde uitgebreide niveau van extracellulaire matrix gevonden in de meeste weefsels. Hier doen we verslag van een methode voor het inbedden en snijden gistkolonies dat het interieur patronen van celtypes openbaart in deze kolonies. De methode kan gebruikt worden om dikke secties voor te bereiden (0,5 μ) nuttig zijn voor lichtmicroscopie en dunne secties (0,1 μ) geschikt voor transmissie elektronenmicroscopie. ASCI en pseudohyfale cellen kunnen gemakkelijk te onderscheiden van eivormige gistcellen met lichtmicroscopie, terwijl het interieur structuur van deze cellen kan worden gevisualiseerd door EM.
De methode is gebaseerd op de omliggende kolonies met agar, infiltreert ze met medium Spurr, en dan snijden. Kolonies met een diameter in het bereik van 1-2 mm zijn geschikt voor dit protocol. In aanvulling op het visualiseren van het interieur van de kolonies, de methode maakt het mogelijk visualisatie van de regio van de kolonie dat de onderliggende agar binnendringt.
Protocol
1. Kolonie Isolatie en fixatie Incubeer 300 kolonies op agar medium voor de aangegeven tijd (een geïsoleerde kolonie moet 1-2 mm in diameter). Verwijder de kolonie (naar boven) en de onderliggende medium met behulp van een smalle spatel. Plaats een paar druppels van 2% agar 42 ° C op een objectglaasje met behulp van een mL Pipetman tip en meteen plaats kolonie op agar naar boven voordat het stolt. Plaats een paar druppels van 2% agar 42 ° C op kolonie en laat stollen. <li…
Discussion
De gepresenteerde methode toont het interieur structuren van de kolonies. Omdat de methode effectief is bij het bepalen van de patronen van celtypen in een reeks van S. cerevisiae stammen met verschillende kolonie morfologie, en ook in een verwante soorten S. paradoxus 5, de methode is ook kans om te werken op een breed scala van schimmels en andere micro-organismen.
Een kritische stap voor het succes van de methode is om ervoor te zorgen dat de gehele kolonie, waar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek werd gefinancierd door NIH 1R15GM094770.