Summary
Um método para a incorporação de colônias de leveduras permitindo o corte de microscopia óptica e eletrônica. Este protocolo permite a determinação da distribuição de células esporuladas e células pseudohyphal dentro colônias fornecendo uma nova ferramenta para a compreensão da organização de tipos de células dentro de uma comunidade de fungos.
Abstract
Padronização dos diferentes tipos de células de embriões é um mecanismo fundamental no desenvolvimento metazoários. Comunidades de microrganismos, tais como colônias e biofilmes também exibem padrões de tipos de células. Por exemplo, na levedura S. cerevisiae, células e células esporuladas pseudohyphal não são uniformemente distribuídos em colônias. A importância funcional da padronização e os mecanismos moleculares que fundamentam esses padrões ainda são pouco compreendidos.
Um desafio que diz respeito à investigação de padrões de tipos de células em colônias de fungos é que, diferentemente do tecido metazoários, as células em colônias são relativamente fracamente ligados um ao outro. Em particular, colônias de fungos não contêm o mesmo nível extensivo de matriz extracelular encontrado na maioria dos tecidos. Aqui nós relatamos em um método para a incorporação e secção colônias de leveduras que revela o interior padrões de tipos de células nessas colônias. O método pode ser usado para preparar seções espessas (0,5 μ) úteis para microscopia de luz e cortes finos (0,1 μ) adequado para microscopia eletrônica de transmissão. Células ascos e pseudohyphal podem ser facilmente distinguidas das células de levedura ovóide por microscopia de luz, enquanto a estrutura interior destas células pode ser visualizado por EM.
O método baseia-se em torno colônias com agar, infiltrando-los com o meio Spurr, e depois do corte. Colônias com um diâmetro na faixa de 1-2 mm são adequados para este protocolo. Além de visualizar o interior das colônias, o método permite a visualização da região da colônia, que invade o agar subjacente.
Protocol
Discussion
O método apresentado revela as estruturas interior das colônias. Porque o método é eficaz na determinação dos padrões de tipos de células em um intervalo de S. cepas cerevisiae com morfologias diferentes colônia, e também em uma espécie aparentada S. paradoxus 5, o método também é passível de trabalhar em uma grande variedade de fungos e outros microorganismos.
Um passo crítico para o sucesso do método é garantir que toda a colônia, incluindo a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pesquisa foi financiada pelo NIH 1R15GM094770.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | ||
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | ||
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 | |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 | |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA | |
| 2-Dimethyl aminoethanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE | |
| Mounting media | KPL | 71-00-16 | ||
| Rotating wheel | Ted Pella | Pelco 1055 | ||
| Microtome | Leica | Ultracut S |
References
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