偏上皮細胞へのプラスミドのマイクロインジェクションによる低分子量GTPaseの機能を解析する
Summary
この記事では詳細はマイクロインジェクション法を用いて偏光上皮細胞における低分子量GTPaseの過剰発現と解析に関わる手順を。
Abstract
頂端部が"無料"の表面と側底膜に直面している生化学的及び機能的に異なる心尖部と側底部領域にそれらの形質膜分極上皮細胞は、基板と隣接セルに接触している。両方の膜ドメインは、拡散障壁を形成するタイトジャンクション、で区切られています。このようなマディン-ダービーのような上皮細胞イヌ腎臓（MDCK）細胞はポリカーボネートフィルターに高密度で播種し、1 2、数日間培養する。アピカル-基底外側偏光は、培養に成功しrecapitulatedすることができます細胞極性の確立と維持は、RalA、Cdc42と、Rab8、Rab10とRab13 3 4 5 6 7などのRasスーパーファミリーの低分子量GTPaseの配列によって調節されている。不活性なGDP結合状態とアクティブなGTP結合状態の間にあるすべてのGTPアーゼのようなこれらのタンパク質は、サイクル。ヌクレオチド結合領域に特異的な変異は、このサイクル8で干渉する。例えば、Rab13T22Nは恒久的に、GDP -フォームとこのように呼ばれる"ドミナントネガティブ"にロックされてRab13Q67LはもはやGTPを加水分解しないことができる一方、その結果、'支配的なアクティブな"状態7にロックされます。その機能を解析するために細胞内でGTPアーゼの両方ドミナントネガティブと支配的なアクティブな対立遺伝子は、通常は内因性タンパク質9の機能を妨害するために高レベルで発現されています。短時間で過剰発現の高いレベルを達成するためにエレガントな方法は、フィルタはマイクロインジェクション法を用いてサポートしている上に成長させた偏細胞の核に直接関連するタンパク質をコードするプラスミドを導入することである。これはしばしば、特に心尖部または側底部にソートされている細胞膜受容体をコードするレポータープラスミドの同時注入と組み合わされます。頻繁に側底部にソート貨物を分析するために使用される貨物は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSVGts045）10の温度に敏感な対立遺伝子である。このタンパク質は39℃で正しく折り畳まれないことができると関心の調節タンパク質が細胞質ゾルで組み立てている間にこのように小胞体（ER）に保持されます。 31日までのシフト° Cその後VSVGts045は形質膜11にERや旅行を、適 切に折り畳むままにすることができます。このチェイスは、一般的にクリーンな結果につながる、さらにタンパク質の合成を防ぐために、シクロヘキシミドの存在下で行われる。ここでは詳細に側底選別に関与する調節タンパク質の包括的な分析を可能にする温度変化を含む偏光セルとその後のインキュベーションにプラスミドをマイクロインジェクションの手順を説明します。
Protocol
Discussion
成功するマイクロインジェクションの実験のための最も重要なステップは、DNAや細胞の極性の品質と純度です。極性細胞がなければ、あなたの噴射制御が既にVSVGをmistargetedことになり、実験は使用できません。 DNAは低品質のものである場合、DNAは、貧しい人々やすべてにおいて所望のタンパク質の無発現を導く注射針を詰まらせることができる。また、そのようなpRKVなどの高い発現レベル?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、H. Fölschへの健康（GM070736）の国立研究所からの助成金によって賄われていた。 SFアンリーは、A * STAR大学院奨学金の受賞によってサポートされていました、そしてRS姜氏は病の研修プログラムの細胞と分子基盤（GM8061）によってサポートされていました
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| Axiovert 200 Microscope with heated stage | Carl Zeiss Inc | Custom order |
| Injectman NI2 Femtojet micromanipulator | Eppendorf | Custom order |
| Femtotips II (Microinjection needles) | Eppendorf | 930000043 |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 |
| Clear 12-mm transwell filter supports | Corning Costar | 3460 |
| Endotoxin-free plasmid maxiprep kit | Sigma-Aldrich | NA0400 |
References
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