Summary
Dermatitis herpetiformis (DH) IgA ve epidermal transglutaminaz (ETG) arasında otoimmün bir reaksiyon ile karakterize kronik inflamatuar bir durumdur. DH gluten duyarlı ve / veya çölyak hastaların çok küçük bir kısmında gelişir. Bu çalışmanın sonuçları, DH de Rhesus maymun konak idiyopatik dermatit semptomları ile geliştirebilir göstermektedir.
Abstract
Doku transglutaminazı 2 (tTG2) zaten kısmen sindirilmiş diyet gluten örneğin gliadin peptitleri deamidates bir bağırsak sindirim enzimi. Genetik yatkınlığı olan bireylerde, tTG2 tTG2 antikorların üretimi ve ince bağırsak duvarının 1,2 içine doğrudan birikimi ile karakterize otoimmün yanıtları tetikler. Bu antikorların varlığı çölyak hastalığı (CD) en önemli işaretlerinden birini oluşturmaktadır. Epidermal transglutaminaz (ETG), CD hastaların küçük bir azınlık bir otoantijen olarak da işlev görebilir transglutaminaz ailenin bir başka üyesi. Bu nispeten nadir durumlarda, ETG klinik olarak herpetiform dermatit (DH) olarak bilinen bir otoimmün reaksiyonu (deri döküntüsü) tetikler. CD ve DH patogenez mekanizması tam olarak bilinmemekle birlikte, bilindiği tTG2 ve CD ve DH hastalarda 3,4 hem de serum antikorları tarafından kabul edilebilir hisse antijenik epitoplar ETG
(macaca mulatta) (Tablo 1, Şekil 1 ve 2) deri lezyonları biyopsi örneklerinin konfokal mikroskop incelemesi etkilenen dokuların çalışmak için kullanılmıştır. Bir hayvan (EM96) IgA ve tTG2 antikorlar (Şekil 3) spektral örtüşme olduğu gösterilmiştir. Çift pozitif tTG2 varlığı + IgA + hücreler dermal papilla çevresindeki derin epidermis duruldu. Bu lezyonlar DH hastaların 3 açıklanan tutarlı. EM96 bir glutensiz diyet, dermatit, yanı sıra yerleştirildi tTG2 + IgA + mevduat kayboldu ve artık (Şekil 1-3) saptanabilir edildi. Dermatit EM96 diyet gluten (gösterilmemiştir) yeniden giriş dayalı, ancak ortaya çıkıverdi. Hayvan ile ilgisiz dermatit de dahil olmak üzere diğer makaklarda, tTG2 + IgA + mevduat tespit edilmedi. TTG2, varlığı ile birlikte EM96 dermatit Glutensiz diyet bağımlı remisyon + IgA +, cilt hücreleri öneririz otoimmün bir, DH-gibiBu durumun geliştirilmesi için mekanizma. Bu herhangi bir insan dışı primat DH-benzeri dermatit ilk rapor.
Protocol
1. Cilt biyopsisi örnek toplama
- Önce cilt biyopsisi işlemi, 2,5 mg / tiletamine hidroklorür ve zolazepam hidroklorür telazol karışımı (Fort Dodge Hayvan Sağlığı, Fort Dodge, IA) kg intramusküler hayvanları uyutmak. Uzanma kadar anestezik yönetimi hayvanlar izleyin ve sonra da onların muhafaza kaldırmak.
- Ilgilendiren bir boyutu 40 bıçak (Oster Profesyonel Ürünler, McMinnville, TN) ile bir Oster Altın A5 Tek Hız Veteriner Clipper kullanan deri alanından saç çıkarın ve aseptik betadin fırçalayın ve alkol alternatif hazırlamak. Seçilen biyopsi sitesi üzerinden steril bir Fenestre asmak sabitleyin.
- Alet hafif basınç saat yönünde ve saat yönünün tersine 180 derece dönerken punch biyopsi subkutan ti dermal katmanlardan ile transects kadar steril bir tekniği kullanarak, deri karşı 4,0 mm Miltex Punch Dermal Biyopsi aleti (Miltex York, PA)ssue. Biyopsi örneği çıkarın ve forseps ve deri altı doku ile cilt transeksiyon kısmını kavramak.
- 3-0 naylon sütür ile çapraz desen 3 / 8 daire kesici iğne (Ethilon, Ethicon, Johnson & Johnson Medikal Limited, Berkshire, İngiltere) bağlı cilt defekti kapatın. Bütün hayvanların post operatif analjezi için 0.01 mg / kg intramusküler buprenorfin hidroklorür (Hospira, Lake Forest, IL) verin.
2. Örnek işleme
- Kronik dermatit ve sağlıklı kontrol deri biyopsi örnekleri ile İş rhesus makaklarda. 02:58 (çapı 4 mm) her hayvan numuneleri biyopsi alın.
- 24 saat boyunca çinko formalin (Z-fix, Anatech Ltd, Battle Creek, MI) Fix ilk örnek, ASP300 Leica doku işlemci (Leica Microsystems Inc, 30 dakika süreyle suda yıkayın% 70 etanol içinde kısa bir süre yıkama yeri ve Buffalo Grove, KS doku,% 70,% 80,% 95 ve% 100 etanol 48 artan notları ile susuz)ksilen (Fisher) tarafından iki değişiklik her (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), dk.
- Oda sıcaklığında uzun vadeli depolama için, parafin medya (Balıkçı) gömün. Kesit için 20 dakika önce-20oC yerleştirin. 6 mikron bölümlerde döner mikrotom (HM325, Microm International, Waldorf, Almanya) kullanarak hazırlayın. Ücret slaytlar (Balıkçı) ve bir gecede 60 ° C kuru hava yerleştirin bölümleri. Leke ile hematoksilen ve eozin (H & E) standart yöntemi (aşağıda açıklanmıştır).
- Fix ikinci örnek oda sıcaklığında 30 dakika süreyle% 2 paraformaldehid (USB Corp, Cleveland, Ohio), fosfat üç defa yıkamak salin (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA)% 30 sakaroz (Balıkçı), tamponlu 4 saat ve Ekim dondurma orta (Sakura Finetek, Torrence, CA) gömmek. Kesit için 20 dakika önce-80oC tutun. 15 mikron bölümleri Kriyostat (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI) kullanarak hazırlayın.
3. H & E boyama
- Embed Deparaffinizeüç değişiklik% 100,% 95 iki değişiklik, bir değişim ve% 80 distile su, 2 dakika her üç xylene (Balıkçı) değişiklikleri ve kademeli ethanols yoluyla rehidrate ile ded kesitler.
- Bir dakika için hematoksilen (Richard Allan Bilimsel, Kalamazoo, MI) Leke ve musluk suyu çalıştırarak kısa bir yıkama tarafından takip.
- Eozin (Sigma) ile 6 dakika Counterstain.
- 2 dakika her iki değişiklikler ve ardından xylene üç değişikliklere açık, her biri 3 dakika,% 95 ve mutlak etanol ile lekeli dokuları dehydrate.
- H & E boyalı doku bölümleri üzerinde Cytoseal Montaj Orta kullanarak Dağı coverglass (Richard Allan Bilimsel).
4. Histopatolojik değerlendirme
Bir SPOT Insight dijital fotoğraf makinesi (Dijital Instruments Inc, Michigan, ABD) ile 40x büyütme ve Leica mikroskop - 4 kullanarak ışık mikroskobu altında H & E boyalı biyopsi cilt bölümleri inceleyin.
5. Immunofluorescent staining
- Immunofluorescent boyama OCT gömülü cilt bölümleri ile çalışın. Boyamadan önce, 20 dakika PBS içinde% 0.1 ile% 0.2 Triton X-100 (Sigma) OCT kaldırmak ve doku permeabilize balık derisi jelatin (FSG, Sigma) içeren bekletin.
- Slaytları yıkadıktan sonra, oda sıcaklığında 1 saat süreyle PBS-FSG seyreltilmiş% 10 normal keçi serumu (NGS, Sigma) ile nemlendirilmiş bir slayt odası, kuluçkaya yatmaktadır.
- IgA ve tTG2 antikorlar birikimi görselleştirmek için, 1 saat süreyle% 10 NGS-PBS-FSG sulandırılmış anti-rhesus IgA ve tTG2 birincil antikorlar, slaytlar kuluçkaya yatmaktadır.
- 10 dakika, 10 dakika süreyle PBS-FSG tarafından takip PBS-FSG-Triton X-100 (Sigma) ile yıkayın.
- 1:1,000 seyreltme Alexa Fluor florokrom 488 (yeşil), 568 (kırmızı) veya 633 (mavi) (Moleküler Probları-Invitrogen) ile etiketli ikincil, izotip-özgül antikorlar ile inkübe edin. ToPro-3 boya, nükleer DNA görselleştirmek için kullanın. Antikor seyreltici olarak% 10 NGS-PBS-FSG kullanın.
- Lekeli doku kesitlerinde monte etmek için anti-su verme solüsyonu (Sigma) kullanın.
6. Konfokal görüntüleme
Argon-Kripton lazer 488 nm (yeşil), 568 nm dalga boyunda bir Kripton lazer (üç lazerler (kullanılabilir uyarma altı satırlık) ile donatılmış bir Leica TCS SP2 Gerçek Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (Leica, Wetzlar, Almanya) ile görüntüleme gerçekleştirin kırmızı) ve görünür spektrumun uzak kırmızı tarafına yayılmış 633 nm (mavi), helyum-neon lazer. Etiketli mimari dokusu değerlendirilmesi için Kayıt diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleri.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil tTG2 ve IgA antikorları hem de ETG pozitif tanıma bir örnek gösterilmiştir. 3A. Tutarlı insan hastalarda durum ve rhesus makaklarda de gluten duyarlılığı CD-DH-benzeri dermatit daha çok daha düşük yaygınlık nedeniyle, deri biyopsi örneklerinin en sho bekleniyorw, ancak tTG2 + IgA + çift pozitif hücreler (Şekil 4) varlığı olmadan tTG2 antikorları ile pozitif reaksiyon. Mikrobiyal kökenli dermatit vakalar da dahil olmak üzere bu durumlarda, DH-ilgisiz, epitel altında dağınık bazı tek pozitif IgA + hücreler ortaya ama tTG2 ve IgA etiketli belirteçleri (Şekil 3B ve 4) arasında spektral örtüşme. Bu nedenle, histopatolojik değerlendirme (Şekil 2) ve başka daha yaygın dermatit sebep olan ajanların yalnızca tespit edilebilir, konfokal tarafından klinik muayene (Şekil 1) ile başlayan, önerilen test prosedürleri düzeni sağlamak için önemlidir. tTG2 ve IgA için lekeli cilt biyopsi mikroskop incelemesi garantilidir. Tek başına klinik ve / veya histopatolojik değerlendirme, bu durumun olumlu bir tanı için yeterli değildir. Bu durumlarda çift-pozitif (tTG2 + IgA +), DH-benzeri hücreler dermal papilla alanı çevresinde tespit dermatit tanısı verilebilir. Bu gibi durumlarda diyet gluten, yoksunlukve dermatit semptomları hafifletmek için glutensiz bir diyet uygulaması tavsiye edilir.
Şekil 1. önce EM96 makak Kasık bölge (A) ve sonrası (B) 5 hafta boyunca diyet gluten çekilmesi. Diyet gluten yeniden yerleştirilmesi dermatit yeniden ortaya çıkma (C) ile çakıştı.
Şekil 2 HE, önce toplanan EM96 makak deri biyopsi boyama (A) ve sonrası (B) 9 hafta boyunca diyet gluten çekilmesi . A: Epitel hiperkeratotik hücreleri kalın bir yüzeysel kabuk yozlaşan nötrofiller ile infiltre (7-15 kat epitel hücrelerinin) kalındır. Nötrofiller epitel içinde de görünür ve lenfositler, plazma hücreleri ve üst dermiste etrafındaki etrafında histiyositler orta numaraları ile karıştırılır. B: Bazı hyperkeratosis hala mevcut, üst dermiste minimal lenfoplazmositik infiltrasyon epitel kalınlığı (4-7 katman) normalize edilir. C: hiçbir lenfoplazmositik infiltrasyon FR56 makak Normal karın cilt, karşılaştırma için yer almaktadır. Büyütme 20x.
Şekil 3, önce toplanan EM96 makak deri biyopsi mikroskopisi görüntüleri (A) ve sonrası (B) 9 hafta boyunca diyet gluten çekilmesi . A: IgA boyama (yeşil), tTG2 (kırmızı) ve ToPro-3 nükleer DNA marker (mavi). IgA ve tTG2 Co-lokalizasyon dermal papilae alanı etrafında sarı görünür. B: Cilt örneği 9 hafta sonra alınan bazı subepitelyal IgA, (yeşil) hala tTG2 (kırmızı) ve ToPro-3 nükleer DNA marker (mavi) mevcut ise glutensiz diyet epitel içinde hiçbir IgA gösterir.
Şekil 4.
| Hayvan Etiketi | Seks [E / K] | Yaş [Yıllar] | Klinik Belirtileri | Plazma tTG2 antikorlar | Diyet [1,2] * |
| HJ71 | F | 1,3 | Sağlıklı | - | 1 |
| HD13 | M | 1,4 | Sağlıklı, zaman zaman ishal | + | 1 |
| FR56 | M | 5,4 | Kronik idiopatik diyare | - | 1 |
| EM96 | F | 5,0 | Kronik dermatit | + / - (Sınırda) | 1 ve 2 |
| GI24 | F | 4,6 | Kronik dermatit | - | 1 |
(Tablo 1). TNPRC rhesus deri biyopsi toplama için kullanılan makaklarda
* Diyet 1 - Düzenli maymun chow (gluten içeren) Diyet 2 - glutensiz diyet
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gluten hassasiyeti yeni kurulan insan dışı primat modeli son zamanlarda diyet gluten 5,6 ile tetiklenen bağırsak geçirgenliği değişiklikleri incelemek için kullanılır. Plazma tTG2 antikorlar yanı sıra bağırsak tTG2 + IgA + mevduat glutene duyarlı bazı makaklarda tespit edildi. Son zamanlarda rhesus koloni hiçbir olağan (metabolik / enfeksiyöz) etiyoloji kurulamadı makaklarda, idiyopatik dermatit nadir olayların tespit yılından bu yana, bu çalışmanın amacı değerlendirmek için ise tTG2 + IgA + antikor mevduat bu nadir durumlarda cilt örneklerinde tespit edilebilir dermatit (Tablo 1).
1:70 ve 1:200 7 arasında CD aralıkları göstergesidir tTG2 otoantikorların prevalansı. Gluten duyarlı makaklarda çalışmalar esir tTG2 antikorlar bu yaygınlığı gösterir rhesus insan nüfusunun bildirilen benzer makaklarda. O ölçüde etkileyen olabilir İlköğretim çevresel ve genetik faktörlerinf, hem insan ve hem de makaklarda prevalansı 8,9 understudied. DH (1:400 için 1:10,000) bir CD'ye göre daha düşük yaygınlık ile ilişkili faktörler de bilinmemektedir. Bu nedenle, daha titiz araştırma CD ve DH patogenezinde çalışmaya ihtiyaç vardır. Bu rapor, insan dışı primat DH-benzeri dermatit varlığını göstermek için ilk. DH-benzeri dermatit bu yaygınlığına rağmen de makaklarda glutene duyarlı enteropati yaygınlığı daha düşük olduğu görünüyor, sunulan sonuçlar, DH-benzeri dermatit ek hayvanlar tespit olacağını varsayarak, gelecekteki araştırmalar için umut veriyor. Çift pozitif tTG2 tespiti + IgA + etkilenen hayvanların deri biyopsilerinde hücre konfokal mikroskobu ile bu çalışmalara vesile olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar Amanda Tardo, Dr. Mostafa Bouljihad Stephanie Feely Carol Coyne, Dr. Erin Ribka, Dr. Pete Didier ve Dorothy Kuebler, teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH hibe R01-DK076653 ve KS 3R01 DK076653-02S1 ve TNPRC RR000164 temel işletim hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human IgA-FITC * | Sigma-Aldrich | F-5259 | 1:100 working dilution |
| Anti-Human tTG2 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | MS-300-P1ABX | 1:100 working dilution |
| Anti-Mouse IgG1 ** | Invitrogen | A-21124 | 1:1,000 working dilution |
| ToPro-3 DNA probe *** | Invitrogen | T-3605 | 1:1,000 working dilution |
| Zinc Formalin (Z-fix) | Anatech Ltd., Battle Creek, MI | 171 | |
| OCT Freezing Medium | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cytoseal Mounting Medium | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Anti-Quenching Solution | Sigma-Aldrich | P 3130 | |
| Ethilon (Nylon Suture) | Ethicon Inc. | 663G | |
| Miltex Punch Dermal Biopsy Instrument | Miltex Inc. | NA | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with a size 40 blade | Oster Professional Products | 78005-050 | |
| Leica Tissue Processor | Leica Microsystems | ASP300 | |
| Rotary Microtome | Microm International | HM325 | |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HM560 | |
| Confocal Microscope | Leica, Wetzlar | TCS SP2 | |
| * Fluorescein isothiocyanate ** Secondary (Alexa Fluor 568-conjugated) antibody used after tTG2 primary antibody ** Dye |
|||
References
- Diosdado, B., Wijmenga, C. Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients. Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).
- Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management. Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).
- Sardy, M. Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis. J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).
- Rose, C. Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet. J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).
- Bethune, M. Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques. PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).
- Mazumdar, K. Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from α-2 gliadin in gluten-sensitive macaques. PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).
- Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies. Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).
- Hunt, K. Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response. Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).
- Abadie, V. Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis. Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).
