Быстрый<em> В естественных условиях</em> Анализ для проверки нейромодуляторных соединений с использованием гигантских системы волокон (GFS) в<em> DROSOPHILA MELANOGASTER</em> Описано. Nanoinjections в голову животного, а также электрофизиологические записи GFS может выявить биологическую активность соединений на нейроны или мышц.
Скрининга соединений в естественных условиях деятельности могут быть использованы в качестве первого шага для выявления кандидатов, которые могут быть разработаны в 1,2 фармакологических агентов. Мы разработали новый nanoinjection / электрофизиологии анализа, что позволяет обнаружить эффекты биологически активных соединений модулирующим на функции нейронов схема, которая является посредником побега ответ дрозофилы MELANOGASTER 3,4. Наш анализ в естественных условиях, в котором используется волоконно дрозофилы гигантские System (GFS, рис. 1) позволяет скрининг различных типов соединений, таких как малые молекулы или пептиды, и требует лишь минимальных количествах, чтобы вызвать эффект. Кроме того, дрозофилы GFS предлагает большой выбор потенциальных молекулярных мишеней на нейроны или мышц. Гигантские волокна (GFS) синапсов электрически (щелевые контакты), а также химически (холинергических) на периферийных Synapsing интернейронов (PSI) и Tergo Trochanteral мышцы нейрона (TTMn) 5 </sup>. PSI в DLMn (спинного продольного нейронов мышц) соединения зависит от Dα7 никотиновые рецепторы ацетилхолина (nAChRs) 6. И, наконец, нервно-мышечных соединений (NMJ) в TTMn и DLMn со скачком (TTM) и летных мышц (DLM) являются глутаматергической 7-12. Здесь мы показываем, как придать nanoliter количества соединений, при получении электрофизиологических внутриклеточных записей из системы гигантских волокон 13 и как осуществлять мониторинг воздействия соединений на функции этой цепи. Мы покажем специфику анализа с methyllycaconitine цитрата (MLA), нАХР антагонист, который нарушает PSI в DLMn связи, но не ГФ TTMn связи или функции NMJ в прыжке или полете мышцы.
Перед началом этого видео очень важно, чтобы вы внимательно смотреть и познакомиться с Юпитер видео под названием "Электрофизиологические Записи с Гигантские Путь волоконно Д. Melanogaster »от Августина и др. 7, как видео, представленные здесь, предназначены в качестве расширения для этого существующий метод. Здесь мы используем метод электрофизиологической записи и сосредоточиться подробно только на того парных nanoinjections и мониторинга техники.
Nanoinjection / электрофизиологии биопроб, представленные здесь позволяет быстрого скрининга соединений в нервной системе плодовой мушки. Это роман в естественных условиях техника, которая требует небольшого количества соединений, чтобы выявить влияние на различные молекулярные мише…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы выразить признательность членам Марий лаборатории и Godenschwege лаборатории, в частности, Алина Йонезава, комментарии и помощь с этим протоколом. Эта работа финансировалась Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта грант R21NS06637 в FM и TAG, AB финансировалось Национальным научным фондом награды число 082925, URM: интегративной биологии для будущих исследователей.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Recording glass electrodes: borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 1.0mm OD, 0.58mm ID |
Stimulator | Grass Instruments | Model S48 | |
Amplifier | Getting Instruments Inc. | Model 5A | |
Data acquisition Software: Digidata | Molecular Devices | Model 1440A | |
Data collection software: pCLAMP | Molecular Devices | Version 10 | |
Stereomicroscope with fiber optic microscope ring illuminator | AmScope | SM-4T Model HL250-AR |
|
Dissecting scope for mounting | AmScope | SM-2TZ | |
Kite Manual Micromanipulator & Tilting Base | World Precision Instruments | Model # M3301 Kite: Model # KITE-M3-L |
|
Drosophila melanogaster Wild 10E genotype (wild type strain) | Bloomington Stock center | Stock # 3892 | |
Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | Model 700c | |
Injection glass micropipettes: Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | Catalogue # 4878 | 1.14mm OD, 0.5mm ID |
Silicon oil | Fisher | Catalogue # S159-500 | |
Beveler | Sutter Instrument Co. | K.T. Brown Type Model # BV-10 |
|
Nanoliter2000 | World Precision Instruments | Catalogue # B203XVY | |
Blue food coloring | McCormick | N/A | Ingredients: Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1, and 0.1% Propylparaben (preservative). |
Methyllycaconitine citrate (MLA) | Tocris Bioscience | Catalogue # 1029 | |
Plastic wax sticks | Hygenic Corporation (Akron Ohio USA) |