Site spécifique génie chromosome bactérien: ΦC31 intégrase médiation Cassette Exchange (IMCE)
Summary
Une méthode rapide et efficace d'intégrer l'ADN étranger dans des souches d'intérêt accepteurs pré-faites, dites souches piste d'atterrissage, est décrite. Procédé permettant d'intégration spécifique de site d'une cassette d'ADN dans le locus piste d'ingénierie d'une souche donnée, par conjugaison et l'expression de l'intégrase ΦC31.
Abstract
Le chromosome bactérien peut être utilisé pour maintenir de façon stable l'ADN étranger dans la plage méga-base 1. Intégration dans le chromosome contourne questions comme la réplication du plasmide, le plasmide de la stabilité, incompatibilité plasmidique, et le plasmide de la variance du nombre de copies. Cette méthode utilise l'intégrase spécifique de site à partir du phage Streptomyces (Φ) C31 2,3. L'intégrase catalyse une recombinaison ΦC31 direct entre deux sites d'ADN spécifiques: attB et attP (34 et 39 pb, respectivement) 4. Cette recombinaison est stable et ne pas revenir 5. Un "piste" (LP) de séquence constitué par un gène de résistance à la spectinomycine-, aadA (SpR), et le E. coli ß-glucuronidase gène (uidA) flanqué par des sites attP a été intégré dans les chromosomes de Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi et Agrobacterium tumefaciens dans une région intergénique, l'ampC locus, et le locus tetA, respectivement. S. meliloti est utilisé dans ce protocole. Vecteurs donateurs mobilisables contenant des sites attB flanquant un stuffer protéine fluorescente rouge (RFP) gène et un gène de résistance aux antibiotiques ont également été construits. Dans cet exemple la gentamicine pJH110 plasmide de résistance est utilisé. Le gène DP 6 peuvent être remplacés par une construction souhaité à l'aide Sph I et Pst I. Sinon, une construction synthétique flanqué par des sites attB peut être sous-cloné dans un vecteur mobilisable comme pK19mob 7. L'expression du gène de l'intégrase ΦC31 (cloné à partir d'pHS62 8) est entraîné par le promoteur lac, sur une large gamme d'hôtes mobilisable plasmide pRK7813 9.
Un protocole d'accouplement tetraparental est utilisé pour transférer la cassette des bailleurs de fonds dans la souche LP remplaçant ainsi les marqueurs dans la séquence LP avec la cassette des bailleurs de fonds. Ces cellules sont trans-intégrants. Trans-intégrants sont formées avec un rendement typique de 0,5%. Trans-intégrants se trouvent généralement dans les premières colonies 500-1000 dépistées par la sensibilité aux antibiotiques ou bleu-blanc de dépistage utilisant le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-acide glucuronique (X-gluc). Ce protocole contient les procédures d'accouplement et de sélection pour la création et l'isolement de trans-intégrants.
Protocol
Discussion
La technique IMCE permet l'intégration efficace d'une cassette d'ADN flanqué attB unique dans le LP-lieu d'une souche auparavant conçu. Une fois la construction désirée est cloné en place de la DP pour créer la cassette des bailleurs de fonds, la technique ne nécessite pas de purification ultérieure de l'ADN et de la transformation, ce qui rend très robuste. Il est essentiel que les contrôles de croissance appropriés sont inclus, pour être certain de la résistance aux …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pour Margaret Smith CM d'avoir bien voulu fournir le clone de l'intégrase
Le soutien financier de:
Génome Canada / Génome Prairie
La découverte du CRSNG et des subventions de projets stratégiques
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Streptomycin | Bioshop Canada Inc. | STP101 | |
| Spectinomycin | Bioshop Canada Inc. | SPE201 | |
| Gentamicin | Bioshop Canada Inc. | GTA202 | |
| Choramphenicol | Bioshop Canada Inc. | CLR201 | |
| Tetracycline | Bioshop Canada Inc. | TET701 | |
| Kanamycin | Bioshop Canada Inc. | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | Bioshop Canada Inc. | AGR001 | |
| Tryptone | Bioshop Canada Inc. | TRP402 | |
| Yeast Extract | Bioshop Canada Inc. | YEX401 | |
| Sodium Chloride | Bioshop Canada Inc. | SOD001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop Canada Inc. | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology Inc. | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In house, available by request | ||
| E. coli pJH110 strain | In house, available by request | ||
| SmUW227 strain | In house, available by request |
References
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