Быстрый и эффективный способ для интеграции чужеродной ДНК интерес в готовых акцептором штаммов, называемых штаммов посадочной площадки, описан. Метод позволяет на конкретных участках интеграции ДНК кассету в инженерных локус площадку приземления данного штамма, через сопряжение и выражения ΦC31 интегразы.
Бактериальной хромосомы могут быть использованы для поддержания стабильно чужеродной ДНК в мега-база от 1. Интеграция в хромосому обходит такие вопросы, как плазмиды репликации плазмиды стабильности, плазмиды несовместимости, и плазмиды дисперсии числа копий. Этот метод использует сайт-специфические интегразы из Streptomyces фага (Φ), C31 2,3. ΦC31 интегразы катализирует прямой рекомбинации между двумя определенными участками ДНК: attB и attP (34 и 39 б.п. соответственно), 4. Это рекомбинация является стабильной и не возвращается 5. "Посадочная площадка" (LP) последовательность, состоящая из спектиномицину ген устойчивости, Aada (СРП), и Е. палочки бета-глюкуронидазы ген (uidA) в окружении сайтов attP была интегрирована в хромосомах Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi и Agrobacterium tumefaciens в межгенных региона, утрапКл локус, и тета локус, соответственно. С. meliloti используется в данном протоколе. Mobilizable векторы донора содержащие attB сайтов фланговые писака красный флуоресцентный белок (RFP) гена и гена устойчивости к антибиотикам, также были построены. В этом примере гентамицина устойчивы плазмиды pJH110 используется. Ген RFP 6 может быть заменен на желаемую конструкцию использованием Sph я и Pst I. Кроме того синтетическая конструкция в окружении attB сайты могут быть суб-клонирован в вектор mobilizable таких как pK19mob 7. Выражение ΦC31 интегразы гена (клонированы из pHS62 8) приводится в движение промоутер лак на mobilizable широкий спектр хозяин плазмиды pRK7813 9.
Tetraparental протокола спаривания используется для передачи доноров кассету в LP штамм тем самым заменив маркеры в последовательности LP с донорами кассету. Эти клетки являются переходыS-интегрантов. Транс-интегрантов формируются с типичной эффективностью 0,5%. Транс-интегрантов которые обычно встречаются в первые 500-1000 колонии экранируется чувствительность к антибиотикам или сине-белые скрининга с использованием 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуроновой кислоты (X-Gluc). Этот протокол содержит спаривания и процедуру отбора для создания и выделения транс-интегрантов.
IMCE техника позволяет эффективно интегрировать одного attB окружении ДНК кассету в LP-локус ранее инженерии штамм. Как только желаемый конструкция клонированных вместо ППП для создания доноров кассеты, техника не требует последующей очистки ДНК и трансформации, что делает его о…
The authors have nothing to disclose.
Для Маргарет Смит CM за любезно предоставленные интегразы клон
Финансирование поддержки:
Геном Канада / Геном Prairie
NSERC Discovery и стратегических проектов гранты
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Streptomycin | Bioshop Canada Inc. | STP101 | |
Spectinomycin | Bioshop Canada Inc. | SPE201 | |
Gentamicin | Bioshop Canada Inc. | GTA202 | |
Choramphenicol | Bioshop Canada Inc. | CLR201 | |
Tetracycline | Bioshop Canada Inc. | TET701 | |
Kanamycin | Bioshop Canada Inc. | KAN201 | |
Bacteriological grade agar | Bioshop Canada Inc. | AGR001 | |
Tryptone | Bioshop Canada Inc. | TRP402 | |
Yeast Extract | Bioshop Canada Inc. | YEX401 | |
Sodium Chloride | Bioshop Canada Inc. | SOD001 | |
Calcium Chloride | Bioshop Canada Inc. | CCL444 | |
X-gluc | Gold Biotechnology Inc. | G1281C1 | |
E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
E. coli pJC2 strain | In house, available by request | ||
E. coli pJH110 strain | In house, available by request | ||
SmUW227 strain | In house, available by request |