Summary
被形容为一个简单的方法，分析相关的上皮细胞组织成纤维细胞的影响。这种方法和三维组织培养相结合，可以方便从3D隔离后的细胞分析。该技术适用于不同恶性潜能的细胞，使系统的研究对肿瘤细胞的肿瘤相关基质的影响。
Abstract
虽然已经进入了巨大的努力识别信号通路和分子参与正常细胞和恶性行为1-2，使用传统的二维细胞培养模型，这项工作已完成，允许细胞操纵方便。它已成为明确的细胞内信号通路的影响外的力量，包括维和细胞的表面张力3-4。已采取多种途径，开发三维模型，更准确地反映生物组织架构3。虽然这些模型纳入多维度和建筑讲，由此产生的对细胞影响的研究是比在两维模型的局限性和困难，在随后的分析中提取细胞组织培养的简便。
重要作用，肿瘤周围的微环境在肿瘤发生的行为我之所以成为越来越认识4。肿瘤基质是由多种细胞类型和细胞外分子。在肿瘤的发展有肿瘤细胞和基质细胞之间的双向信号。虽然参与肿瘤基质协同进化的一些因素已经确定，仍然有必要制定简单的技术，系统地识别和研究这些信号6阵列。成纤维细胞是最丰富的细胞类型，在正常或肿瘤相关间质组织，促进基底膜和旁分泌生长因子7的沉积和维护。
许多团体已经使用三维培养系统研究成纤维细胞的各种细胞功能的作用，包括肿瘤反应治疗，免疫细胞招聘，信号分子，细胞增殖，凋亡，血管生成，侵袭8-15。我们已经优化了屁股的简单方法对乳腺上皮细胞，使用市售的细胞外基质的模型来创建三维混合细胞群（联合培养）16-22文化essing乳腺成纤维细胞的影响。续共培养细胞的形成与球体内部的聚类成纤维细胞和上皮细胞很大程度上取决于外部的球体，形成多细胞的预测，到矩阵。操纵改变上皮细胞的侵袭，导致成纤维细胞可以很容易量化的数量和长度23上皮预测的变化。此外，我们已经制定为隔离上皮细胞三维共培养，促进成纤维细胞的对上皮行为暴露的影响分析的方法。我们已经找到了合作文化的影响，持续数周后上皮细胞的分离，允许充裕的时间来执行多个检测。这种方法是适应细胞不同恶性潜能，不需要专门的设备。这种技术允许多个条件下，在体外细胞模型的快速评估和相应的结果，可以在动物体内组织模型以及人体组织样本。
Protocol
1。建立三维共培养
- 建立联合培养的前一天，从4℃冰箱中冷冻和解冻冰基底膜一夜之间。
- 在当天的实验，准备共同的文化，它对应的上皮细胞，可用于介质（在这个例子中的三菱电梯中等介质：DME/F12介质与10％小牛血清，5微克/毫升胰岛素1微克/毫升氢化可的松，1毫微克/毫升表皮生长因子）。保持冰至少1小时前与基底膜混合介质。
- 冲淡了解冻的基底膜，确定总的基底膜所需数量：中型（300μL，每口井的24孔板），并添加冰冷的三菱电梯中等量的一半，上冰的无菌管。然后加入相同的半解冻基底膜总量管达到1:1稀释。管置于冰上。
- 50μL基底膜：中等混合中旬在指定的24孔板井井孵育10分钟在37℃孵化器与湿润的空气和5％的CO 2。
- 添加一个额外的基底膜450微升：中等混合井和孵育60分钟。
- 孵化期间，准备在浓度为0.5×10的成纤维细胞（H-叔永生减少乳腺成纤维细胞表达GFP）和上皮细胞（H-叔永生化人类乳腺上皮细胞系表达利福平）1:1暂停5细胞每0.5毫升三菱电梯中等。
- 经过60分钟的孵化步骤，轻轻地放到固化凝胶的顶部细胞悬液，并返回文化的孵化器。
- 请勿打扰2天的文化。在此之后，媒体可以改变每2-3天非常轻轻地吸气和更换新鲜的三菱电梯介质轻轻从一侧的媒介。
- 每天监测显微镜下的球体形成。文化一般经过10-14天成熟。形象适当使用光或荧光显微镜。光学显微镜下可测椭球的大小和投影长度。
2。从球体共培养的细胞的分离
- 非常轻柔，吸取文化和使用无菌的2 mL的玻璃吸管下降10倍。另外，切断了1000微升塑料吸管尖端使用高压灭菌或70％的乙醇浸泡消毒的剪刀，以吸取文化的一角。转让与玻璃吸管或无菌的15 mL离心管切割塑料枪头，在2000年，在室温下转离心5分钟的文化。细胞球体将在底部的沉积物。
- 使用无菌巴斯德枪头轻轻地清除破坏基底膜的离心管顶部。
- 加入1毫升三菱电梯中等颗粒球体，吸取2毫升无菌玻璃吸管的2-3倍，在24孔和转让，以良好的文化组织培养板。
- 允许的球体附加到盘前至少48小时，以改变介质。随着时间的推移，细胞会离开的球状结构，并成长为单层。
- 通过细胞培养，当细胞达到50％汇合。首先，扩大文化，以35毫米的菜（约2-4天），然后到100毫米菜（约3-5天）。紧接每个通道步骤，使用无菌巴斯德吸管许多残余的“鬼球体”尽可能手动删除。
- 流动人口使用适当的细胞表面标志物，并进一步区分不同细胞群的纯度，如果有必要的荧光细胞分选仪分析细胞。孤立的细胞现在准备需要作进一步的分析。
3。代表结果
在三维球体的共同文化，与工程Tiam 1 mRNA沉默的成纤维细胞诱导成马增加入侵乳腺上皮细胞基质（ 图1，比较D，E，F到一，乙，丙类）。与成纤维细胞工程的Tiam 1 mRNA的过度表达诱导的乳腺癌细胞株SUM159（ 图1，比较G，H，J，K L来）减少矩阵入侵。
一旦已经建立了合作培养球体，细胞群可以被孤立在一个二维的情况下再镀球体， 如图2所示。根据测试细胞的相对增长率，纯种群可能会出现通过串行通道（ 如图3所示），或可以使用适当的细胞标记进行排序。从3D共培养分离后，上皮细胞保留了长时间的成纤维细胞共培养赋予的属性，允许充分的机会进行分析。在这个例子中，暴露Tiam 1 mRNA的缺陷成纤维细胞诱导合作培养HMECs的移民增加，坚持几个星期1fter隔离3D共培养（ 图4）。
图1。成像光镜和荧光显微镜下建立球体的共同文化。球体文化的建立与乳腺上皮细胞和成纤维细胞系，并允许在文化成长为10-14天。自动对焦：上皮=三菱电梯mCherry细胞。 GL：上皮细胞= SUM159-mCherry细胞的。交流，GI：成纤维细胞=控制旋转磁场-GFP的细胞。 DF：成纤维细胞= RMF的绿色荧光蛋白与Tiam 1 mRNA沉默。 JL：成纤维细胞= RMF的绿色荧光蛋白与Tiam 1 mRNA的过度表达。箭头表示成矩阵入侵上皮预测。
图2。光，荧光显微镜从基底膜文化隔离后下的文化序列成像。 0天表示成像后，立即隔离; 1天，25表明天隔离后。离开球体随着时间的推移增加细胞日冕。最后一个“鬼”有极少数细胞球体仍然（箭头）。很少球体后仍然鬼拆除和第一段。
图3。流流式细胞仪分析细胞从基底膜共培养后的隔离。后球体的共同的文化已经成熟，从移液器3D共培养和串行传代细胞分离。流式细胞仪检测样品等分（在这个例子中使用绿色荧光和红色荧光标识的GFP分别表达mCherry表达的成纤维细胞和上皮细胞的），以确定相对人口的上皮细胞和成纤维细胞。
图4。Transwell小室迁移的HMECs后仍然isolati从基底膜合作的文化。一旦纯种群已获得通过文化或荧光细胞分选，细胞可以分析的需要。在这里，无论是对照组（C）或Tiam 1 mRNA缺陷（SHT）跨穿孔transwells的成纤维细胞共培养HMECs迁移隔离共培养2，4和8周后评估。
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Discussion
这里介绍的方法代表着一个简单的方法分析，包括肿瘤细胞的上皮细胞间质成纤维细胞的影响。它允许直接的细胞内细胞外基底膜基质的三维背景的互动，作进一步的分析，同时使基质细胞容易提取。这可以应用于研究肿瘤相关基质，成纤维细胞系可以被操纵，影响信号通路的选择和上皮线，可以在不同的侵入性的潜力，如在图1所示。三维共培养模型，使细胞侵袭的变化已经引起视觉验证。隔离协议允许提取细胞的三维培养与处理的最低，并避免了胰蛋白酶或基质溶解剂的使用，可能会影响细胞的特性。 3D共培养成纤维细胞接触的影响，坚持在船尾的上皮细胞呃隔离3D共培养，促进后续分析（ 图4）。虽然这里显示的例子描述了对细胞迁移的影响，孤立的细胞可用于细胞生长在2D适用于任何检测。我们已经用这种方法来分析不同的成纤维细胞相关的乳腺上皮细胞的行为Tiam1表达的影响。 Tiam 1 mRNA成纤维细胞中的不足，促进乳腺肿瘤细胞的侵袭和转移的三维培养和动物肿瘤模型23。这种方法使我们能够分析潜在参与的途径，利用分子，生化和功能分析（刘和Buchsbaum，在新闻）。
重要的是要使用只有在良好的健康的细胞株，并坚持严格的无菌技术，以防止在这个过程中的文化污染。取得最好的结果是使用从早期的细胞，而不是后期的段落（精确的通道数会有所不同根据特定在50-80％之间的汇合密度IC细胞）和细胞收获。基底膜的精确处理，根据协议，以便前两个完整的液化建立联合培养，并彻底凝固之前，以确保除了细胞矩阵是关键。不足的金额或凝固的矩阵将导致在生长的细胞为单层，而不是在文化中的球体。当第一次建立球体的共同文化，最初的50μL插件放置在井允许最后的矩阵，其中的关键是均匀分布的球体形成坚实的锚定和更均匀的凝固。去除所有的鬼球体隔离后通过的步骤是非常关键的，如果是用于自动化的细胞分选，分离混合种群。这里显示的例子，使用约10毫克/毫升含蛋白质成分酚红免费基底膜。酚红的自由准备允许在ASSA色检测YS，如荧光。
这种技术可以应用到一系列的细胞类型，以研究相关的上皮细胞肿瘤或相关成纤维细胞对肿瘤细胞的效果相反的基质细胞的影响。这种技术允许多个条件下，在体外细胞模型的快速评估和相应的结果，然后可以在动物体内组织模型以及人体组织样本。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Phenol-red free |
| Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | |
| Hyclone Bovine Calf Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3007303 | |
| Insulin | EMD Millipore | 407709 | Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter |
References
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