Summary
Простой метод описан для анализа последствий ткани фибробласты об ассоциированном эпителиальных клеток. Сочетание этого метода и трехмерной тканевой культуре могут облегчить анализ клеток после изоляции от 3D. Методика распространяется на клетки различных злокачественных потенциал, позволяющий систематическое изучение последствий опухолеассоциированным стромы на опухолевые клетки.
Protocol
1. Создание трехмерных сотрудничества культур
- За день до создания совместного культур, удалить Матригель из морозильной камеры и оттепель на льду в 4 ° C ночь в холодильник.
- В день эксперимента, подготовить среду для совместной культуры, что соответствует средним для эпителиальных клеток, которые будут использоваться (HMEC среды в данном примере: DME/F12 среде с 10% бычьей сыворотки теленка, 5 мкг / мл инсулина , 1 мкг / мл гидрокортизона, 1 нг / мл ЭФР). Держите среды на лед по крайней мере, за 1 час до смешения с Матригель.
- Чтобы разбавить талой Матригель, определения общего требуемого количества Матригель: средний (300 мкл на лунку 24-луночных планшетов) и добавить 1/2, что объем ледяной HMEC среднего стерильную пробирку на льду. Затем добавьте же половина общего объема талых Матригель к трубе для достижения разведение 1:1. Держите трубку на льду.
- Место 50 мкл Матригель: средние смеси в середине и в специально отведенных для скважины 24-луночного планшета иинкубировать 10 мин при 37 ° C инкубатор с увлажненного воздуха и 5% CO 2.
- Добавить еще 450 мкл Матригель: средняя смесь в лунки и инкубировать в течение еще 60 минут.
- Во время инкубации, готовит 1:1 подвески фибробластов (здесь А-трет-увековечены сокращение молочной Фибробласты выражения GFP) и эпителиальные клетки (здесь А-трет-увековечены молочной железы человека линии эпителиальных клеток, экспрессирующих RFP) в концентрации 0,5 · 10 5 клеток каждая в 0,5 мл HMEC среды.
- После 60-минутной инкубации, мягко отказаться от клеточной суспензии на верхнюю часть затвердевшего геля, и вернуть культуры в инкубатор.
- Не беспокоить культур в течение 2 дней. После этого среда может менять каждые 2-3 дней, очень мягко аспирационных среду со стороны хорошо и аккуратно заменить свежими HMEC среды.
- Мониторинг формирования сфероида ежедневно под микроскопом. Культура, как правило, зрелого через 10-14 дней. Изображение, каксоответствующие помощью света или люминесцентной микроскопии. Сфероид размер и длину проекции могут быть измерены при световой микроскопии.
2. Выделение ячейки из сфероид сотрудничества культур
- Очень осторожно, пипетка культура вверх и вниз 10 раз, используя стерильный 2 мл стеклянную пипетку. Кроме того, отрезать кончик 1000 мкл пластиковой пипетки с помощью ножниц стерилизовать автоклавированием или погружения в 70% этанолом, чтобы пипетировать культуры. Передача культуры либо с помощью пипетки или стеклянной разрезе пластиковый наконечник пипетки в стерильную центрифужную пробирку 15 мл, а центрифуги в течение 5 мин со скоростью 2000 оборотов в минуту при комнатной температуре. Сотовые сфероидов будет осадок на дне.
- Используйте стерильные пипетки Пастера, чтобы мягко удалить нарушенный Матригель сверху центрифугировали трубку.
- Добавить 1 мл HMEC среднего гранулированный сфероидов, пипетка вверх и вниз по 2-3 раза с 2 мл стерильной стеклянной пипетки, и передавать культуру и в 24-апластины тканевой культуры.
- Позвольте сфероидов приложить к блюду, по крайней мере за 48 часов до изменения среды. Со временем клетки оставят сфероидальной структуры и расти, как монослоев.
- Прохождение культурах клеток, когда клетки достигают 50% слияния. Первое расширение культуры 35 мм блюдо (примерно 2-4 дней), а затем до 100 мм блюдо (примерно 3-5 дней). Непосредственно перед началом каждого прохода шаг, использовать стерильные пипетки Пастера, чтобы вручную удалить столько остаточного "призрак сфероидов", как это возможно.
- Анализ клеток методом проточной цитометрии для населения чистоты с помощью соответствующих маркеров клеточной поверхности и дальнейшему отдельных различных клеточных популяций с помощью флуоресцентной сортировки клеток, если это необходимо. Изолированных клеток готовы для дальнейшего анализа, как хотелось бы.
3. Представитель Результаты
В трехмерном сфероида со-культур, фибробластов инженерных Tiam1 глушителей вызывать увеличился вторжения в маматрице на эпителиальных клетках молочной (рис. 1, сравнить D, E, F, А, B, C). Фибробласты с инженерии по-выражение Tiam1 вызывать снизилась матрицы вторжения клетки рака молочной железы линии SUM159 (рис. 1, сравнить J, K, L на G, H, I).
После совместного культурного сфероидов были созданы, клеточных популяций могут быть выделены из сфероидов повторным покрытием в двумерном контексте, как показано на рисунке 2. В зависимости от относительной скорости роста клеток испытания, чистый населения могут появиться через последовательный переход (как показано на рисунке 3) или могут быть отсортированы с помощью соответствующих маркеров клеток. После выделения из 3D совместно культуры, эпителиальные клетки сохраняют свойства предоставляемых совместно культуры фибробластов в течение длительного периода времени, что позволяет широкие возможности для анализа. В этом примере воздействия Tiam1 дефицитом фибробластов индуцированных повышенной миграции в сотрудничестве культурный HMECs, что сохраняется в течение неделиосле изоляции от 3D-со-культуры (рис. 4).
Рисунок 1. Изображений установленных сфероида со-культур в свете и флуоресцентной микроскопии. Сфероид культуры создаются с молочной эпителия и фибробластов клеточных линиях и могут расти в культуре в течение 10-14 дней. AF: эпителиальные = HMEC-mCherry клеток. GL: эпителиальные клетки = SUM159-mCherry клеток. AC, GI: фибробластов = контроль RMF-GFP клеток. ДФ: фибробластов = RMF-GFP с Tiam1 глушителей. ДЛ: фибробластов = RMF-GFP с Tiam1 за выражение. Стрелки указывают эпителиальных прогнозы вторжения в матрице.
Рисунок 2. Последовательные изображения культур под светом и флуоресцентной микроскопии после выделения из культуры Матригель. День 0 представляет изображения сразу после изоляции, дни 1, 2 и5 показывают дней после изоляции. Корона клеток оставив сфероид увеличивается с течением времени. В конце концов "призрак" сфероида очень мало клеток остается (стрелка). Очень немногие сфероидов остаются после удаления призраков и первый проход.
Рисунок 3. Проточная цитометрия анализа клеток после выделения из Матригель со-культуры. После сфероида со-культуры созрели, клетки выделяют из 3D совместно с пипеткой культуры и серийные пассажи. Пример аликвоты исследуют методом проточной цитометрии (в данном примере использования зеленого свечения и красной флуоресценции для определения выражения GFP-фибробласты и mCherry экспрессией эпителиальных клеток соответственно), чтобы определить относительную населения эпителиальных клеток и фибробластов.
Рисунок 4. Transwell миграции HMECs сохраняется после isolatiо сотрудничестве с Матригель-культуры. После чистого населения были получены через культуру или флуоресценции сортировки клеток, клетки могут быть проанализированы как хотелось бы. Здесь миграции HMECs совместной культурной либо контроля (С) или Tiam1 недостаточности (шт) фибробласты через перфорированную transwells был оценен в 2, 4 и 8 недель после выделения из со-культуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод представленный здесь представляет собой простой подход к анализу последствий стромальных фибробластов на эпителиальных клетках, в том числе опухолевых клеток. Это дает возможность прямого межклеточного взаимодействия в трехмерном контексте поддержке внеклеточного матрикса базальной мембраны, позволяя легко извлечения клеток из матрицы для последующего анализа. Это может быть применен к изучению опухолевого стромы, а фибробластов линии можно манипулировать, чтобы влиять на сигнальные пути выбора и эпителиальных линий может варьироваться в инвазивный потенциал, как показано на рисунке 1. 3D совместной культуре модель позволяет визуального контроля, что изменения в клеточной инвазии были вызваны. Изоляция протокол позволяет для извлечения клеток из 3D культур с минимальной обработкой и избегает использования трипсина или матрицы, растворяющие вещества, которые могут повлиять на свойства ячеек. Последствия воздействия фибробластов в 3D со-культура сохраняется в эпителиальных клетках кормоваяэ изоляции от 3D-со-культуры, содействия последующего анализа (рис. 4). Хотя пример, показанный здесь, изображает влияние на миграцию клеток, любой анализ, применимые к клеток, растущих в 2D может быть использован на изолированных клетках. Мы использовали этот метод для анализа влияния различных фибробластов Tiam1 выражения в поведении связанных молочной эпителиальных клеток. Tiam1 дефицит фибробластов способствует опухоли молочной железы вторжения клетки и метастазы в 3D культуры и животных моделях опухолей 23. Этот метод дает возможность анализировать потенциальные участие путей с использованием молекулярных, биохимических и функциональных тестов (Liu и Буксбаума, в печати).
Важно использовать только клеточные линии, в отличном здоровье и придерживаться строгой стерильности во избежание загрязнения культур в ходе процесса. Наилучшие результаты получены при использовании клеток с начала, а не поздних пассажах (точное число прохождения будет варьироваться в зависимости от specifIC клеточной линии) и клеток, полученных при плотности в пределах 50-80% слияния. Точная обработка Матригель в соответствии с протоколом является ключевым для того, чтобы способствовать как полный сжижения до создания совместного культур и обеспечить полное затвердевание матрицы перед добавлением клеток. Недостаточное количество или затвердевания матрицы приведет клеток, растущих в виде монослоя, а не в сфероидов в культуре. При первом создании сфероида со-культур, размещение первоначальный 50 мкл подключить также позволяет твердой привязки и более равномерного затвердевания окончательной матрицы, которая является ключом к равномерно распределены сфероид образования. Удаление всех призраков сфероидов в изоляции после прохождения шагов является критическим, если автоматизированной сортировки клеток будет использоваться для разделения смешанных популяций. Примеры, приведенные здесь использовать фенол-красный бесплатно Матригель с белковый состав около 10 мг / мл. Фенол-красный бесплатно подготовка позволяет определение цвета в ассаЮ.С., такие как флуоресценция.
Этот метод может быть применен к различным типам клеток с целью изучения последствий стромальных фибробластов на связанных эпителиальных опухолей или, наоборот, воздействие на опухолевые клетки, связанные фибробластов. Этот метод позволяет быстро оценки в моделях пробирке клетки под несколько условий, и соответствующие результаты можно сравнить в естественных тканей животных моделей, а также образцы человеческих тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Phenol-red free |
| Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | |
| Hyclone Bovine Calf Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3007303 | |
| Insulin | EMD Millipore | 407709 | Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin. Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).
- Li, H., Fan, X., Houghton, J. Tumor microenvironment: the role of the tumor stroma in cancer. J. Cell Biochem. 101, 805-815 (2007).
- Tse, J. C., Kalluri, R. Mechanisms of metastasis: epithelial-to-mesenchymal transition and contribution of tumor microenvironment. J. Cell Biochem. 101, 816-829 (2007).
- Bhowmick, N. A. TGF-beta signaling in fibroblasts modulates the oncogenic potential of adjacent epithelia. Science. 303, 848-851 (2004).
- Bhowmick, N. A., Moses, H. L.
- Havlickova, B., Biro, T., Mescalchin, A., Arenberger, P., Paus, R. Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial-mesenchymal interactions. Br. J. Dermatol. 151, 753-765 (2004).
- Kilani, R. T. Selective cytotoxicity of gemcitabine in bladder cancer cell lines. Anticancer Drugs. 13, 557-566 (2002).
- Seidl, P., Huettinger, R., Knuechel, R., Kunz-Schughart, L. A. Three-dimensional fibroblast-tumor cell interaction causes downregulation of RACK1 mRNA expression in breast cancer cells in vitro. Int. J. Cancer. 102, 129-136 (2002).
- Silzle, T. Tumor-associated fibroblasts recruit blood monocytes into tumor tissue. Eur. J. Immunol. 33, 1311-1320 (2003).
- Bartling, B., Demling, N., Silber, R. E., Simm, A. Proliferative stimulus of lung fibroblasts on lung cancer cells is impaired by the receptor for advanced glycation end-products. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 34, 83-91 (2006).
- Kunz-Schughart, L. A. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290, C1385-C1398 (2006).
- Liu, T., Lin, B., Qin, J. Carcinoma-associated fibroblasts promoted tumor spheroid invasion on a microfluidic 3D co-culture device. Lab Chip. 10, 1671-1677 (2010).
- Zengel, P. Multimodal therapy for synergic inhibition of tumour cell invasion and tumour-induced angiogenesis. BMC Cancer. 10, 92-92 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Heyder, P., Schroeder, J., Knuechel, R. A heterologous 3-D coculture model of breast tumor cells and fibroblasts to study tumor-associated fibroblast differentiation. Exp. Cell Res. 266, 74-86 (2001).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Cell-cell interactions in spheroids maintained in suspension. Acta Oncol. 45, 412-420 (2006).
- Hirschhaeuser, F. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Hoevel, T., Macek, R., Swisshelm, K., Kubbies, M. Reexpression of the TJ protein CLDN1 induces apoptosis in breast tumor spheroids. Int. J. Cancer. 108, 374-383 (2004).
- Paduch, R., Kandefer-Szerszen, M. Vitamin D, tamoxifen and beta-estradiol modulate breast cancer cell growth and interleukin-6 and metalloproteinase-2 production in three-dimensional co-cultures of tumor cell spheroids with endothelium. Cell. Biol. Toxicol. 21, 247-256 (2005).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720-e2720 (2011).
- Xu, K. The role of fibroblast Tiam1 in tumor cell invasion and metastasis. Oncogene. 29, 6533-6542 (2010).
