シナプス蛍光の自動定量<em> C.エレガンス</em
Summary
シナプスでクラスタ化された神経伝達物質受容体の存在量は強くシナプス強度に影響を与えます。このメソッドは、の単シナプスの分解能で三次元的に蛍光標識された神経伝達物質受容体を定量化する<em> C.エレガンス</em>、シナプスの数百人が急速にz-平面の投影によって導入された歪みがなく、単一試料内で特徴づけることができるようになります。
Abstract
シナプス強度が前シナプス神経伝達物質の放出イベントへのシナプス応答の振幅を表し、全体的な神経回路の機能に大きな影響を与えます。シナプスの強さは批判的にシナプス後膜上のシナプス部位でクラスタ化された神経伝達物質受容体の量に依存。受容体レベルは、発達が確立され、シナプス可塑性と神経調節の重要なメカニズムを表す表面ローカライズされ、シナプス、細胞内プールの間に受容体の輸送によって変更することができます。シナプスにローカライズされた神経伝達物質受容体の存在量を定量化する厳密な方法は、シナプスの開発と可塑性を研究するために不可欠である。それは非シナプスプールからシナプスを区別し、シナプスの種類に応じてローカライズされた受容体の個体の間で区別する、空間情報を維持するために蛍光顕微鏡では、最適なアプローチです。遺伝的モデル生物線虫elegansは特に無傷の動物のネイティブシナプスの検査を可能にする、小型サイズとその神経系の相対的なシンプルさ、透明性、および強力な遺伝学的手法の利用に起因するこれらの研究に適しています。
ここでは、Cで蛍光標識されたシナプスの神経伝達物質受容体を定量するための方法を提示エレガンス 。その主な特徴は、マルチプレーン共焦点顕微鏡の出力ファイル、集計の位置、ボリューム、蛍光強度と、各シナプスの総蛍光の三次元の個々のシナプスの自動識別と分析である。このアプローチは、共焦点のデータをz平面投影の手動分析上の2つの主要な利点があります。共焦点のデータセットのすべての面が含まれているため、まず、データは通常、ピクセル強度の平均値または最大値に基づいて、z-平面投影を介して失われることはありません。第二に、シナプスの識別は、自動化されていますが、元で検査することができますシナプスの多数からのデータの迅速かつ正確な抽出を可能にするデータ分析が進むにつれてperimenter、。サンプルあたりのシナプスの数百〜数千を容易に得ることができる、大容量のデータを生成する統計的検出力を最大化するために設定します。 Cを調製するための考慮事項分析、および治療 グループ内の動物間のばらつきを最小限にするために共焦点イメージングを行うための線虫についても説明します。 Cを分析するために開発がelegansのシナプス後受容体は、このメソッドは、通常、実際にシナプスにローカライズされたタンパク質、または、離散的なクラスタ、涙点、または細胞小器官に局在化されている任意の蛍光シグナルの任意のタイプのに便利です。
手順は、次の3つの手順で実行されます。1）試料2の製造）は共焦点イメージング、3）画像解析。ステップ1と2 は 、Cに固有のものです線虫は、ステップ3は、一般的に共焦点顕微鏡写真内の任意の点状の蛍光シグナルに適用された。
Protocol
Discussion
ここで紹介するメソッドは、Cのシナプスの大集団の定量的なマルチパラメータデータを抽出するように設計されていエレガンス 、試験治療グループ内の一貫性を最大化しながら。三つの特徴は、これらの目標に貢献しています。最初に、免疫染色はすべての動物が同じ年齢であることを確認し、同期ワーム集団で実行されます。発現レベルの開発規制が実験的治療の効果を不?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、プロトコルの開発を支援するためにA.ベンハムに感謝します。この作品は、BABにNIHの助成金NS06747によって賄われていた
Materials
| Name of the software | Company | Comments (optional) | |||||||
| Volocity v4.0 or higher | PerkinElmer/Improvision | Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity. | |||||||
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||||||||
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| Table 1. Solutions. |
References
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