Geautomatiseerde Kwantificering van synaptische Fluorescentie in<em> C. elegans</em

Summary

De overvloed aan neurotransmitter receptoren geclusterd bij synapsen grote invloed op synaptische sterkte. Deze methode kwantificeert fluorescent gelabelde neurotransmitter receptoren in drie dimensies met single-synaps resolutie in<em> C. elegans</em>, Waardoor honderden synapsen snel worden gekenmerkt binnen een monster zonder misvormingen die z-vlak projectie.

Abstract

Synapse kracht verwijst naar de amplitude van postsynaptische reacties op presynaptische neurotransmitters evenementen, en heeft een grote invloed op de totale neurale circuit functie. Synapse kracht is afhankelijk kritisch over de overvloed aan neurotransmitter receptoren geclusterd op synaptische sites op het postsynaptische membraan. Receptor niveaus in hun ontwikkeling vastgesteld, en kan worden veranderd door receptor handel tussen oppervlakte-gelokaliseerde, subsynaptic, en intracellulaire zwembaden, die belangrijke mechanismen van synaptische plasticiteit en neuromodulatie. Strenge methoden om synaptisch-gelokaliseerde neurotransmitter-receptor overvloed te kwantificeren zijn essentieel voor synaptische ontwikkeling en plasticiteit te bestuderen. Fluorescentie microscopie is een optimale aanpak omdat het behoudt ruimtelijke informatie, waarbij onderscheid wordt synaptische van niet-synaptische zwembaden, en onderscheid te maken tussen de receptor populaties gelokaliseerd in verschillende types van synapsen. De genetische model organisme Caenorhabditis, elegants is bijzonder goed geschikt voor deze studies te wijten aan de geringe omvang en de relatieve eenvoud van het zenuwstelsel, de transparantie, en de beschikbaarheid van krachtige genetische technieken, waardoor het onderzoek van inheemse synapsen in intacte dieren.

Hier presenteren we een methode voor het kwantificeren van fluorescent gelabelde synaptische neurotransmitter receptoren in C. elegans. De belangrijkste functie is de automatische identificatie en analyse van individuele synapsen in drie dimensies in multi-plane confocale microscoop output-bestanden, rangschikken positie, volume, fluorescentie-intensiteit, en de totale fluorescentie voor elke synaps. Deze aanpak heeft twee belangrijke voordelen ten opzichte van handmatige analyse van de z-plane projecties van confocale gegevens. Ten eerste omdat elk gebied van de confocale dataset betrekking hebben, zijn geen gegevens verloren gaan door z-vlak projectie, meestal op basis van pixel intensiteit gemiddelden of maxima. Ten tweede, de identificatie van synapsen is geautomatiseerd, maar kan worden gecontroleerd door de experimenter als de data-analyse opbrengst, waardoor snelle en nauwkeurige extractie van gegevens uit een groot aantal synapsen. Honderden tot duizenden synapsen per monster kunnen gemakkelijk worden verkregen, het produceren van grote datasets te maximaliseren statistische power. Overwegingen voor het bereiden van C. elegans voor analyse, en het uitvoeren van confocale beelden van de variabiliteit tussen de dieren in de behandelingsgroepen een minimum te beperken worden ook besproken. Hoewel ontwikkeld C. analyseren elegans postsynaptische receptoren Deze methode is algemeen bruikbaar voor elk type synaptisch-gelokaliseerde eiwit of zelfs een fluorescentiesignaal die is gelokaliseerd op discrete clusters puncta of organellen.

De procedure wordt uitgevoerd in drie stappen: 1) de voorbereiding van de monsters, 2) confocale beeldvorming, en 3) beeldanalyse. Trappen 1 en 2 zijn aan C. elegans, terwijl stap 3 is over het algemeen van toepassing op alle punctata fluorescentie-signaal in de confocale microscopie.

Protocol

1. Voorbereiding van Worms for Imaging Dit segment van het protocol is gebaseerd op gepubliceerde C. elegans kweektechnieken 1,2, en wordt in figuur 1. Grow wormen op hoge pepton NGM agar platen (10 cm) gezaaid met NA22 E. coli-bacteriën tot bijna uitgehongerd. Als immunokleuringen, zal een bord betrouwbaar produceren genoeg wormen voor 1 persoon vlek, rekening houdend met verliezen langs de weg, en de strenge criteria die worden gebr…

Discussion

De hier gepresenteerde methode is ontwikkeld om kwantitatieve multi-parameter gegevens op te halen voor grote populaties van synapsen in C. elegans, terwijl het maximaliseren van consistentie binnen behandelingsgroepen. Drie functies dragen bij aan deze doelstellingen. Eerst wordt immunokleuring uitgevoerd op synchrone worm populaties om ervoor te zorgen dat alle dieren zijn even oud. Deze stap is essentieel, omdat ontwikkeling regulatie van expressie kunnen verduisteren effecten van de experimentele behandelin…

Materials

Name of the software	Company		Comments (optional)
Volocity v4.0 or higher	PerkinElmer/Improvision		Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity.
			Table 2. Specific reagents and equipment.
			Egg buffer NaCl KCl CaCl2 MgCl2 HEPES (Adjust pH to 7.3) 118 mM 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM Alkaline hypochlorite (for 5 ml) Fresh household bleach (discard bottle 30 days after opening) 10 N NaOH ddH2O 1.0 ml 0.25 ml 3.75 ml
			Table 1. Solutions.