Quantificazione automatica di fluorescenza in Synaptic<em> C. elegans</em
Summary
L'abbondanza dei recettori dei neurotrasmettitori a livello delle sinapsi cluster influenza fortemente la forza sinaptica. Questo metodo quantifica recettori dei neurotrasmettitori marcato in fluorescenza in tre dimensioni con un singolo sinapsi risoluzione<em> C. elegans</em>, Consentendo a centinaia di sinapsi di essere rapidamente caratterizzato all'interno di un campione unico senza distorsioni introdotte dal z-piano di proiezione.
Abstract
Forza Synapse si riferisce alla ampiezza delle risposte post-sinaptici a eventi presinaptici di rilascio dei neurotrasmettitori, e ha un impatto significativo sulla funzione complessiva del circuito neurale. Synapse forza dipende in modo critico l'abbondanza di recettori neurotrasmettitori raggruppati in siti sinaptici sulla membrana postsinaptica. Livelli di recettori sono stabiliti evolutivamente, e può essere alterato da traffico tra i diversi centri del recettore di superficie localizzato, subsynaptic e intracellulare, che rappresentano importanti meccanismi di plasticità sinaptica e neuromodulazione. Metodi rigorosi per quantificare sinapticamente-localizzato abbondanza recettore del neurotrasmettitore sono essenziali per studiare lo sviluppo e la plasticità sinaptica. Microscopia a fluorescenza è un approccio ottimale perché conserva l'informazione territoriale, distinguendo da synaptic non-sinaptici piscine e discriminando tra le popolazioni dei recettori localizzati a diversi tipi di sinapsi. Il modello genetico dell'organismo Caenorhabditis elegans è particolarmente adatto per questi studi a causa della piccola dimensione e la relativa semplicità del suo sistema nervoso, la trasparenza, e la disponibilità di potenti tecniche genetiche, consentendo l'esame di sinapsi nativi in animali intatti.
Qui vi presentiamo un metodo per quantificare marcato in fluorescenza recettori dei neurotrasmettitori sinaptici in C. elegans. La sua caratteristica fondamentale è l'identificazione automatica e l'analisi delle singole sinapsi in tre dimensioni in multi-piano i file di output microscopio confocale, la posizione tabulazione, volume, intensità di fluorescenza e fluorescenza totale per ogni sinapsi. Questo approccio ha due vantaggi principali rispetto analisi manuale di Z-Plane proiezioni di dati confocale. In primo luogo, perché ogni piano del set di dati confocale è incluso, nessun dato viene perso attraverso z-piano di proiezione, in genere basato sulle medie intensità pixel o massimi. In secondo luogo, l'identificazione delle sinapsi è automatizzato, ma può essere ispezionati da exsperimentatore, come procede l'analisi dei dati, che consente l'estrazione rapida e precisa di dati provenienti da un gran numero di sinapsi. Centinaia di migliaia di sinapsi per campione può essere facilmente ottenuto, producendo grandi quantità di dati per massimizzare la potenza statistica. Considerazioni per la preparazione di C. elegans per l'analisi e l'esecuzione confocale a minimizzare la variabilità tra gli animali all'interno dei gruppi di trattamento vengono anche discussi. Nonostante sia stato sviluppato per analizzare C. recettori postsinaptici elegans, questo metodo è generalmente utile per qualsiasi tipo di sinapticamente-localizzata proteina, o addirittura, qualsiasi segnale di fluorescenza che è localizzato a cluster discreti, puncta o organelli.
La procedura viene eseguita in tre fasi: 1) preparazione dei campioni, 2) confocale, e 3) analisi delle immagini. I passi 1 e 2 sono specifici per C. elegans, mentre il punto 3 è generalmente applicabile a qualsiasi segnale di fluorescenza puntata al microscopio confocale.
Protocol
Discussion
Il metodo qui presentato è stato progettato per estrarre quantitativi multi-parametri dati per grandi popolazioni di sinapsi in C. elegans, massimizzando al contempo la coerenza all'interno dei gruppi di trattamento. Tre caratteristiche contribuiscono a questi obiettivi. In primo luogo, immunostaining viene eseguita su popolazioni sincroni a vite senza fine di garantire che tutti gli animali sono la stessa età. Questo passaggio è fondamentale dato che il regolamento per lo sviluppo dei livelli di espress…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare A. Benham per l'assistenza allo sviluppo del protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concessione NS06747 al BAB
Materials
| Name of the software | Company | Comments (optional) | |||||||
| Volocity v4.0 or higher | PerkinElmer/Improvision | Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity. | |||||||
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||||||||
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| Table 1. Solutions. |
References
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