الآلي الكمي من الإسفار متشابك في<em> C. ايليجانس</em
Summary
وفرة من المستقبلات العصبية تتجمع في نقاط الاشتباك العصبي تؤثر تأثيرا قويا قوة متشابك. هذا الأسلوب الكمي المستقبلات العصبية fluorescently المسمى في ثلاثة أبعاد مع قرار واحد في المشبك<em> C. ايليجانس</em>، مما يسمح للمئات من نقاط الاشتباك العصبي يتميز بسرعة في عينة واحدة من دون التشوهات التي أدخلتها Z-طائرة الإسقاط.
Abstract
قوة المشبك يشير إلى اتساع ردود بعد المشبكي إلى إطلاق سراح الأحداث قبل المشبكي العصبي، ولها تأثير كبير على وظيفة الكلية الدائرة العصبية. قوة المشبك يتوقف بصورة حاسمة على وفرة من المستقبلات العصبية تتجمع في مواقع متشابك على الغشاء بعد المشبكي. يتم تحديد مستويات مستقبلات تنمويا، ويمكن تغييرها من قبل الاتجار مستقبلات بين برك السطحية المحلية، تحت المشبك، والخلايا، التي تمثل آليات هامة من اللدونة متشابك وتعديل العمليات العصبية. طرق صارمة لتحديد synaptically المموضع وفرة مستقبلات الناقل العصبي ضرورية لدراسة تطوير واللدونة متشابك. مضان المجهري هو النهج الأمثل لأنه يحافظ على المعلومات المكانية، والتمييز متشابك من غير متشابك حمامات، والتمييز بين السكان مستقبلات مترجمة إلى أنواع مختلفة من نقاط الاشتباك العصبي. الكائن الحي نموذج الجيني Caenorhabditis eleganوبشكل خاص يناسب ق لهذه الدراسات نظرا لصغر حجمها وبساطة النسبي للنظام العصبي، وشفافيتها، ومدى توافر تقنيات وراثية قوية، مما يسمح للفحص من نقاط الاشتباك العصبي في الحيوانات الأصلية سليمة.
هنا نقدم وسيلة لقياس fluorescently المسمى المستقبلات العصبية متشابك في C. ايليجانس. وتتمثل الميزة الرئيسية هي تحديد الآلية وتحليل نقاط الاشتباك العصبي الفردية في ثلاثة أبعاد متعددة في طائرة مبائر ملفات الإخراج المجهر، موقف تبويب، وحجم وكثافة مضان، ومضان الإجمالية لكل المشبك. هذا النهج ميزتان الرئيسية خلال التحليل اليدوي للZ-طائرة التوقعات للبيانات مبائر. أولا، لأنه يتم تضمين كل طائرة من مجموعة البيانات مبائر، يتم فقدان أي بيانات من خلال Z-إسقاط طائرة، تقوم عادة على المعدلات كثافة بكسل أو الحدود القصوى. الثانية، وتحديد نقاط الاشتباك العصبي هو الآلي، ولكن يمكن للتفتيش من قبل القوات المسلحة الرواندية السابقةperimenter كما عائدات تحليل البيانات، مما يتيح استخلاص سريعة ودقيقة للبيانات من عدد كبير من نقاط الاشتباك العصبي. ويمكن بسهولة لمئات الآلاف من نقاط الاشتباك العصبي في عينة يمكن الحصول عليها، وتنتج مجموعات البيانات الكبيرة إلى تحقيق أقصى قدر من القوة الإحصائية. اعتبارات لإعداد C. وتناقش أيضا ايليجانس لتحليلها، وإجراء التصوير مبائر للحد من التباين بين الحيوانات ضمن مجموعات العلاج. على الرغم من أن وضعت لتحليل C. مستقبلات ايليجانس بعد المشبكي، وهذه الطريقة مفيدة بشكل عام في أي نوع من synaptically المموضع البروتين، أو في الواقع، أي إشارة مضان أن يكون موضعيا إلى مجموعات منفصلة، ونقاط و، أو العضيات.
يتم تنفيذ الإجراء في ثلاث خطوات: 1) إعداد العينات، 2) التصوير مبائر، و 3) تحليل الصور. الخطوات 1 و 2 هي محددة لC. ايليجانس، في حين أن الخطوة 3 تنطبق بصورة عامة على أي إشارة مضان منقط في الميكروسكوب متحد البؤر.
Protocol
Discussion
تم تصميم طريقة عرض هنا لاستخراج كمية متعددة المعلمة بيانات عن أعداد كبيرة من نقاط الاشتباك العصبي في C. ايليجانس، في حين تحقيق أقصى قدر من الاتساق ضمن مجموعات العلاج. ثلاث ميزات تسهم في تحقيق هذه الأهداف. أولا، يتم تنفيذ المناعية على السكان دودة متزامن للتأكد من ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر ألف بنهام للمساعدة في تطوير البروتوكول. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS06747 إلى BAB
Materials
| Name of the software | Company | Comments (optional) | |||||||
| Volocity v4.0 or higher | PerkinElmer/Improvision | Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity. | |||||||
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||||||||
|
|||||||||
| Table 1. Solutions. |
References
- Christensen, M. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).
- Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122, 2517-2527 (1996).
- Davis, K. M. Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans. Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).
- Finney, M., Ruvkun, G. The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans. Cell. 63, 895-905 (1990).
- Rowland, A. M. Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).
- Burbea, M. Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans. Neuron. 35, 107-120 (2002).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).
- Sankaranarayanan, S. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
- McDonald, N. A. Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging. Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).
- Shakiryanova, D. Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).
