قياس كمية Invadopodia بوساطة التحلل البروتيني المصفوفة خارج الخلية في سياقات متعددة الخلايا واحدة و
Summary
نحن تصف طريقة تنميط لإنتاج المجهر coverslips المغلفة مع الجيلاتين الفلورسنت لتصور invadopodia بوساطة تدهور المصفوفة. وتعرض التقنيات الحاسوبية باستخدام البرمجيات المتاحة لقياس مستويات الناتجة من التحلل البروتيني مصفوفة واحدة من قبل خلايا داخل المختلط والسكان للمجموعات متعددة الخلايا المجهرية التي تشمل حقول بأكملها.
Abstract
غزو الأنسجة الخلوية في المحلية هو عملية مهمة في التنمية والتوازن. Malregulated الغزو وما تلاه من حركة الخلايا هو سمة من العمليات المرضية متعددة، بما في ذلك الالتهاب، أمراض القلب والشرايين والأورام الانبثاث الخلية 1. مبؤرة تدهور بروتين من مكونات خارج الخلية (ECM) مصفوفة في الغشاء القاعدي الظهارية أو البطانية هو خطوة حاسمة في بدء الغزو الخلوية. في الخلايا السرطانية، قررت واسعة في تحليل المختبر أن يتم إنجاز ECM من تدهور الهياكل الغشائية البطنية الأكتين الغنية تبارزي وصف invadopodia 2،3. Invadopodia النموذج في بدل بالقرب من ECM، حيث معتدلة ECM انهيار من خلال عمل مصفوفة metalloproteinases (MMPs). قدرة الخلايا السرطانية على تشكيل invadopodia يرتبط بشكل مباشر مع القدرة على غزو سدى في الأوعية الدموية والمكونات المحلية المرتبطة بها 3.
_content "برزت> التصور من تدهور ECM invadopodia بوساطة الخلايا بواسطة المجهر الفلورسنت باستخدام مصفوفة البروتينات صبغ المسمى المغلفة coverslips على الزجاج والأسلوب الأكثر انتشارا لتقييم درجة التحلل البروتيني مصفوفة الخلوية وإمكانات الغازية 4،5. نحن هنا وصف يتم تحجيم بسهولة نسخة من الطريقة القياسية لتوليد coverslips الزجاج fluorescently التي تحمل علامات الاستفادة من ولاية أوريغون الخضراء المتاحة تجاريا-488 المتقارن الجيلاتين. هذه الطريقة لإنتاج بسرعة أعداد كبيرة من coverslips المغلفة. نعرض بعض من القطع الأثرية والمجهرية الشائعة التي غالبا ما واجهت يمكن خلال هذا الإجراء، وكيف يمكن تجنب هذه. وأخيرا، نحن تصف أساليب موحدة متاحة بسهولة باستخدام برامج الكمبيوتر للسماح الكمي للتدهور صفت مصفوفة الجيلاتين بوساطة الخلايا الفردية والسكان الخلوية بأكملها. والإجراءات المذكورة توفير القدرة على رصد دقيق وبتكاثر invadopodiaالنشاط، ويمكن أيضا أن تكون بمثابة منصة لتقييم فعالية بروتين تعبير تحوير أو اختبار المضادة للمركبات الغازية على تدهور المصفوفة خارج الخلية في أماكن متعددة الخلايا واحدة و.Protocol
1. إنتاج الخضراء ولاية أوريغون 488-الجيلاتين المغلفة Coverslips إعداد الخالي من الملصقات 5٪ (وزن / وزن) سوق الأسهم الجيلاتين / حل السكروز بإضافة 1.25 غرام الجيلاتين و 1.25 غرام في PBS السكروز إلى الحجم النهائي من 50 مل. تدفئة محلول ال?…
Discussion
ساعد القدرة على تصور خلايا المصفوفة خارج الخلية المهينة في اكتشاف الآليات الجزيئية المستخدمة في الخطوات الأولى من الغزو الخلية. رائدها ون تيان تشين، في 4،14،15 اوائل عام 1980، برزت البروتينات خارج الخلية طلاء fluorescently المسمى على coverslips الزجاج للتحليل المجهري لاحق ك?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل الصناديق الوقفية من جامعة وست فرجينيا بوب ماري راندولف مركز السرطان. نشكر Susette مولر (جامعة جورج تاون) وكيلي لورا في وقت مبكر للحصول على المشورة والمساعدة. ومن المسلم به بامتنان استخدام مرفق جامعة فيرجينيا الغربية التصوير المجهري (بدعم من مركز السرطان بوب ماري راندولف و، NIH منح P20 RR16440، وRR032138 P30 P30 GM103488).
Materials
| Name of Reagent/Instrument | Company | Catalogue Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
- Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The ‘ins’ and ‘outs’ of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).
- Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src. Nature. 316, 156-158 (1985).
- Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function. Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).
- Ayala, I., et al. Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation. J. Cell Sci. , (2008).
- Ammer, A. G., et al. Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function. J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).
- Seals, D. F., et al. The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells. Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).
- Yamaguchi, H., et al. Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin. J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).
- Kopp, P., et al. The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages. Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).
- Oser, M., et al. Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation. J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Kelley, L. C., et al. Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation. J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).
- Chen, W. T., Singer, S. J. Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).
- Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites. J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).
- Bharti, S., et al. Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes. Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).
- Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity. Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).
- Scott, R. W., et al. kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).
- Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells. J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).
- Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro. Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).
- Baldassarre, M., et al. Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells. Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. ECM degradation assays for analyzing local cell invasion. Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).
- Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia. J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).
- Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia. Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation. J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).
- Li, A., et al. The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion. Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells. Cancer Sci. , (2010).
Tags
Quantitative MeasurementInvadopodia-mediatedExtracellular Matrix ProteolysisSingle And Multicellular ContextsCellular InvasionDevelopmentHomeostasisMalregulated InvasionCell MovementPathological ProcessesInflammationCardiovascular DiseaseTumor Cell MetastasisProteolytic DegradationExtracellular Matrix (ECM)Epithelial Basement MembraneEndothelial Basement MembraneVentral Actin-rich Membrane Protrusive StructuresInvadopodiaMatrix Metalloproteinases (MMPs)Tumor CellsIn Vitro AnalysisECM DegradationFluorescent MicroscopyDye-labeled Matrix ProteinsGlass CoverslipsEvaluating Matrix ProteolysisCellular Invasive Potential
Cite This Article
Martin, K. H., Hayes, K. E., Walk, E. L., Ammer, A. G., Markwell, S. M., Weed, S. A. Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts. J. Vis. Exp. (66), e4119, doi:10.3791/4119 (2012).