Quantitative Messung der Invadopodia-vermittelte extrazellulären Matrix Proteolyse in Einzel-und Multizelluläre Contexts
Summary
Wir beschreiben die prototypische Verfahren zur Herstellung Mikroskop Deckgläser mit fluoreszierenden Gelatine zur Visualisierung invadopodia-vermittelte Matrixabbau beschichtet. Rechenverfahren Verwendung verfügbarer Software für die Quantifizierung der resultierenden Ebenen der Matrix Proteolyse durch einzelne Zellen innerhalb einer Mischpopulation und für Gruppen, die vielzelligen gesamte mikroskopische Felder dargestellt.
Abstract
Cellular Invasion in lokalen Gewebe ist ein Prozess wichtig in der Entwicklung und Homöostase. Malregulated Invasion und anschließende Zellbewegung ist charakteristisch für mehrere pathologische Prozesse, einschließlich Entzündung, kardiovaskulärer Erkrankung und Tumorzellenmetastase ein. Focalized proteolytischen Abbau der extrazellulären Matrix (ECM)-Komponenten in der epithelialen oder endothelialen Basalmembran ist ein kritischer Schritt bei der Einleitung Zellinvasion. In Tumorzellen hat umfangreiche in vitro-Analyse bestimmt, dass ECM Abbau durch ventralen Aktin Membranplattformen vorstehenden Strukturen bezeichnet invadopodia 2,3 bewerkstelligt wird. Invadopodia Form in engen Apposition zu dem ECM, wo sie mäßig ECM Durchschlag durch die Wirkung von Matrixmetalloproteinasen (MMPs). Die Fähigkeit von Tumorzellen gegenüber invadopodia bilden direkt korreliert mit der Fähigkeit, sich in lokalen Stroma und assoziierten vaskulären Bauteile 3 einzudringen.
_CONTENT "> Visualisierung invadopodia-vermittelten Abbau von ECM Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von Farbstoff-markierten Proteine Matrix auf Glas-Deckgläschen beschichtet wurde als die am weitesten verbreitete Technik zum Auswerten des Grades der zellulären Matrix Proteolyse und invasive Potential 4,5 entstanden. Hier beschreiben wir eine Version des Standard-Methode zur Erzeugung fluoreszenzmarkierten Glasdeckgläser Verwendung eines kommerziell erhältlichen Oregon Green 488-Gelatine-Konjugat. Dieses Verfahren ist einfach skaliert rasch bringen zahlreiche beschichtete Deckgläser. Wir zeigen einige der üblichen mikroskopischen Artefakte, die häufig auftreten Während dieses Verfahrens und wie diese vermieden werden. Schließlich haben wir standardisierten Methoden unter Verwendung leicht verfügbarer Computersoftware zur Quantifizierung von markierten Gelatinematrix Abbau durch einzelne Zellen und zellulären Populationen von gesamte vermittelt ermöglichen beschreiben. Die beschriebenen Verfahren bieten die Möglichkeit, genau und reproduzierbar zu überwachen invadopodiaAktivität, und kann auch als Plattform zur Bewertung der Wirksamkeit des Modulierens Proteinexpression oder Testen von Anti-invasiver Verbindungen auf extrazelluläre Matrix Abbau in Einzel-und mehrzellige Einstellungen dienen.Protocol
Discussion
Die Fähigkeit, Zellen zu einer Verschlechterung der extrazellulären Matrix visualisieren hat die Entdeckung der molekularen Mechanismen in den frühen Schritten Zellinvasion beschäftigt unterstützt. Pionierarbeit von Wen-Tien Chen in den frühen 1980er Jahren 4,14,15 hat Beschichtung fluoreszenzmarkierten extrazelluläre Proteine auf Deckgläsern für die anschließende mikroskopische Analyse als primäre Technik bei der Beurteilung invadopodia Funktion in einem breiten Spektrum von Zelltypen entsta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Stiftungsfonds von der West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center unterstützt. Wir danken Susette Mueller (Georgetown University) und Laura Kelley für die frühe Beratung und Unterstützung. Die Verwendung der West Virginia University Microscopy Imaging Facility (unterstützt von der Mary Babb Randolph Cancer Center und NIH Zuschüsse P20 RR16440, P30 und P30 RR032138 GM103488) wird dankbar anerkannt.
Materials
| Name of Reagent/Instrument | Company | Catalogue Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
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