Summary
इन प्रयोगों के लक्ष्य तनु के विकास और जीन अभिव्यक्ति गतिशीलता पर मात्रात्मक समय पाठ्यक्रम डेटा उत्पन्न करने के लिए है
Abstract
इन प्रयोगों के लक्ष्य तनु एस के विकास और जीन अभिव्यक्ति गतिशीलता पर मात्रात्मक समय पाठ्यक्रम डेटा उत्पन्न करने के लिए है ट्यूमर के अंदर से बढ़ साल्मोनेला बैक्टीरिया कालोनियों.
हम एक मानव डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइन के चमड़े के नीचे इंजेक्शन, OVCAR -8 (NCI DCTD ट्यूमर भंडार, फ्रेडरिक, एमडी). द्वारा चूहों में मॉडल xenograft ट्यूमर उत्पन्न
हम एस के तनु उपभेदों तब्दील दृश्य 2 के लिए प्लाज्मिड एक अनिवार्यता से व्यक्त luciferase (luxCDABE) के साथ: साल्मोनेला बैक्टीरिया (SL1344 phoPQ -1 ELH430). माउस 1 के लिए अनिवार्य रूप से गैर विषमय जबकि शेष इन उपभेदों विशेष रूप से ट्यूमर उपनिवेश.
औसत दर्जे का ट्यूमर स्थापित किए गए थे एक बार, बैक्टीरिया खुराक बदलती के साथ पूंछ नस के माध्यम से नसों में इंजेक्शन थे. ट्यूमर स्थानीयकृत, जीवाणु जीन एक्सप्रेशन में एक का उपयोग करते हुए 60 घंटे के कोर्स पर वास्तविक समय में नजर रखी थीvivo इमेजिंग प्रणाली (IVIS) में. हर समय बिंदु पर, ट्यूमर homogenized, excised, और जीन अभिव्यक्ति डेटा के साथ संबंध के लिए बैक्टीरियल कालोनियों quantitate को चढ़ाया गया.
साथ में, इस डेटा ट्यूमर के अंदर बढ़ रही बैक्टीरिया के vivo विकास और जीन अभिव्यक्ति में गतिशीलता का एक मात्रात्मक उपाय पैदावार.
Introduction
सिंथेटिक जीव पिछले दशक में तेजी से प्रगति की है और अब ऊर्जा और स्वास्थ्य के क्षेत्र में महत्वपूर्ण समस्याओं को प्रभावित करने की स्थिति में है. हालांकि, नैदानिक क्षेत्र में विस्तार की सुरक्षा चिंताओं और इन विवो आनुवंशिक सर्किट में के लिए डिजाइन मानदंडों के विकास की अनुपस्थिति से धीमा कर दिया गया है. उच्च प्रभाव चिकित्सा अनुप्रयोगों में तेजी चिकित्सा बुनियादी ढांचे, नियंत्रित प्रयोगशाला की स्थापना के बाहर कार्य करते हैं कि आनुवंशिक सर्किट, और सुरक्षित और चिकित्सकीय स्वीकार माइक्रोबियल मेजबान के साथ सीधे अंतरफलक है कि विधियों के उपयोग की आवश्यकता होगी.
उपभेदों की एक संख्या ट्यूमर में रियायत के तौर पर विकसित करने की क्षमता के कारण कैंसर के उपचार के लिए जांच की गई है. ये सी. शामिल है नोव्यि, ई. कोलाई, वी. cholorae, बी longum, और एस साल्मोनेला 3-8 एस. वे 9-12 मानव नैदानिक परीक्षणों की एक संख्या में सुरक्षा और सहिष्णुता का प्रदर्शन किया है के रूप में साल्मोनेला विशेष रुचि उत्पन्न की है. ये bacteri एक शुरू में मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली की उत्तेजना के माध्यम से और कैंसर सेल चयापचय के लिए आवश्यक पोषक तत्वों की कमी से विरोधी ट्यूमर प्रभाव पैदा करने के लिए दिखाया गया. चिकित्सकीय माल का उत्पादन बाद में आनुवंशिक संशोधनों के माध्यम से जोड़ा गया है. इन अध्ययनों ट्यूमर के उपचार के लिए जीवाणु के उपयोग में महत्वपूर्ण प्रगति का प्रतिनिधित्व करते हैं, वहीं मौजूदा प्रयासों के बहुमत आम तौर पर उच्च dosages, बंद लक्ष्य प्रभाव, और मेजबान प्रतिरोध 13-16 के विकास के वितरण में परिणाम है कि उच्च स्तर की अभिव्यक्ति पर भरोसा किया है .
अब, सिंथेटिक जीव विज्ञान उन्नत संवेदन और वितरण 17-20 प्रदर्शन कर सकते हैं कि computationally से डिजाइन आनुवंशिक सर्किट का उपयोग करके प्रोग्राम माल उत्पादन जोड़ सकते हैं. ये सर्किट ट्यूमर विशेष उत्तेजनाओं और आवश्यक के रूप में स्वयं को विनियमित माल उत्पादन भावना है कि वितरण प्रणाली के रूप में कार्य करने के लिए तैयार किया जा सकता है. हालांकि, vivo में इन सर्किट के समारोह के अध्ययन के इस प्रकार अब तक चुनौतीपूर्ण हो गया है.
प्लास्मिड सिंथेटिक सर्किट के लिए आम ढांचे हैं ve_content "> के बाद से, हम एक माउस मॉडल का उपयोग vivo में प्लाज्मिड आधारित जीन अभिव्यक्ति की गतिशीलता को चिह्नित करने के लिए एक विधि का वर्णन है. इन विधियों समय व्यतीत luminescence इमेजिंग और biodistribution की मात्रात्मक माप का उपयोग. साथ में, इन तरीकों नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए vivo में प्लाज्मिड आधारित नेटवर्क के अध्ययन के लिए एक रूपरेखा प्रदान करते हैं.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. सेल तैयार
- मानक सेल कल्चर तकनीक का उपयोग कर पारित सेल लाइनों. इस प्रयोग में, हम OVCAR -8 कोशिकाओं (NCI DCTD ट्यूमर भंडार, फ्रेडरिक, एमडी) का इस्तेमाल किया. 100% - 80 के confluency एक लक्ष्य के लिए कोशिकाओं को विकसित.
- 5 मिनट के लिए 5 मिलीलीटर trypsin के साथ कोशिकाओं को सेते हैं, तो + एफबीएस trypsin निष्क्रिय करने के लिए 5 मिलीलीटर RPMI मध्यम जोड़ें.
- एक hemocytometer पर फसल और गिनती कोशिकाओं. 5 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल, या कुप्पी प्रति के बारे में 200 μl का लक्ष्य एकाग्रता में फिनोल लाल मुक्त DMEM में Resuspend.
- 15% कम वृद्धि कारक Matrigel (बी.डी. बायोसाइंसेज) जोड़ें और आरोपण तक बर्फ पर सेल निलंबन रखना.
2. ट्यूमर आरोपण
- Isoflurane के 3% का उपयोग कर 4 सप्ताह पुराने महिला Ncr / परमाणु चूहों anesthetize और गहरी संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए लगभग 5 मिनट इंतज़ार करो. संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें.
- एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में कोशिकाओं (ट्यूमर प्रति 100 μl) लोड और एक 27 1 देते हैं/ 2 गेज सुई.
- दो द्विपक्षीय हिंद पार्श्व इंजेक्शन साइटों में से प्रत्येक के लिए एक तम्बू बनाने और आधार पर कोशिकाओं इंजेक्षन संदंश के साथ धीरे त्वचा उठा. रक्त के उत्पादन, भी गहरी पैठ नहीं ख्याल रखना. धीरे छींटे बिना सिरिंज दूर करने के लिए चिमटी का प्रयोग करें.
- 2 के एक ट्यूमर व्यास तक 20 दिन - - 4 मिमी तक पहुँच जाता है 10 के लिए दैनिक ट्यूमर के विकास की निगरानी करें.
3. बैक्टीरिया तैयारी
- एक -80 सी फ्रीजर स्टॉक या प्रशीतित थाली से 3 मिलीग्राम लेग मीडिया + एम्पीसिलीन में बैक्टीरिया की एक रात में संस्कृति की शुरुआत करें. इस प्रयोग में, हम एस इस्तेमाल किया साल्मोनेला तनाव ELH430 (SL1344 PhoPQ-Aroa-).
- सुबह में, फ़िल्टर लेग में संस्कृति 1:100 पतला और OD600 0.4 विकसित करने के लिए - 0.6.
- स्पिन और फॉस्फेट में 3 बार धो खारा (पीबीएस) buffered और 0.1 के अंतिम OD600 (1 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल) के बारे में resuspend.
4. बैक्टीरिया इंजेक्शन
- एक पशु anesthetizeपूंछ अपने प्रमुख हाथ की ओर इशारा करते हुए के साथ अपने पक्ष पर घ स्थिति. संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें.
- गर्म पानी या एक गर्मी दीपक का उपयोग कर पूंछ नस चौड़ा करना.
- एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में बैक्टीरिया (माउस प्रति 100 μl) लोड और 90 डिग्री से भी कम टिप मोड़.
- पूंछ नस के साथ सिरिंज टिप संरेखित, एक उथले गहराई (कोई विरोध नहीं महसूस करना चाहिए) में घुसना, और बैक्टीरिया इंजेक्षन. एक सफल इंजेक्शन के लिए bloodflow विस्थापन का निरीक्षण करें.
5. माउस इमेजिंग
- प्रेरण कक्ष में पशुओं चतनाशून्य तो इमेजिंग मंच पर प्रत्येक माउस जगह. संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें. समय अंक के बीच मात्रात्मक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए सटीक स्थिति बनाए रखें.
- IVIS स्पेक्ट्रम इमेजिंग प्रणाली (कैलिपर लाइफ साइंसेज) का उपयोग कर छवि जानवरों. उन दोनों के बीच इमेजिंग 1 से अधिक पशु, जगह रोशनी बाधाओं को पार Illu को रोकने के लिए यदिmination. पशु बैक्टीरिया का स्थानीयकरण पुष्टि करने के लिए उदर पक्ष पर पहले imaged किया जाना चाहिए.
- छवि जानवरों पृष्ठीय प्रयोग (36 घंटे) की अवधि के लिए IVIS हर 2 घंटे का उपयोग कर. एक दिया रॉय के लिए एक समय पाठ्यक्रम उत्पन्न करें.
6. बैक्टीरियल Biodistribution बढ़ाता
- एक शोषक डायपर पर पीठ पर सीओ 2 और जगह का उपयोग जानवरों euthanize.
- दो हिंद ओर चमड़े के नीचे ट्यूमर का पर्दाफाश करने के लिए पशु मुड़ें. ट्यूमर को अलग करने और निकालने के लिए आसपास के त्वचा के ऊतक में कटौती. चिमटी के साथ ट्यूमर होल्डिंग, उल्टे कैंची गति का उपयोग कर त्वचा को हटा दें. त्वचा के बहुमत अलग किया गया है, पूरी तरह से चिमटी का उपयोग कर ट्यूमर निकाल दें.
- पूर्व तौला microcentrifuge ट्यूबों में अंगों रखें. इन ट्यूबों की बड़े पैमाने पर काफी भिन्न हो सकते हैं के बाद से यह मात्रात्मक परिणाम के लिए उन्हें पूर्व वजन करने के लिए महत्वपूर्ण है.
7. बैक्टीरियल Biodistribution बढ़ाता
- हर समय बिंदु, उत्पाद शुल्क के लिए और ट्यूमर का वजन.
- 500 μl पीबीएस + 15% ग्लिसरॉल जोड़ें और एक ऊतक Tearor (BioSpec) का उपयोग homogenize. नमूने के बीच इथेनॉल के साथ homogenizer 3 बार कुल्ला.
- धारावाहिक dilutions और बैक्टीरियल कॉलोनी गिनती के लिए थाली उत्पन्न करें. एक ही थाली के उपयोग के पूर्व sectioned प्लेटों पर थाली कई dilutions के लिए.
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम ट्यूमर लक्षित बैक्टीरिया के vivo विकास और जीन अभिव्यक्ति में गतिशीलता पर डेटा उत्पन्न करने में सक्षम हैं. समग्र कार्यप्रवाह चित्र 1 में संक्षेप.
पहले चरण में, हम luminescence (नीला) के एक पत्रकार के रूप में साथ जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए IVIS का उपयोग कर पशु बैक्टीरिया इंजेक्षन (हरा) और छवि.
फिर, दूसरे चरण में, हम उत्पाद शुल्क, homogenize, और कॉलोनी की गिनती के लिए थाली ट्यूमर ट्यूमर में बढ़ रही जीवाणुओं की संख्या निर्धारित करने के लिए.
जीवाणु उपभेदों द्वारा उत्पन्न bioluminescence कल्पना का उपयोग कर IVIS (चित्रा 2) है. 5 एक्स 5 10 के आसपास एक न्यूनतम बस्तियां खुराक (2A चित्रा) के साथ इंजेक्शन खुराक के साथ सिग्नल बढ़ जाती है. सभी मामलों में, तनु जीवाणु केवल या तो विशेष रूप से ट्यूमर उपनिवेश या चूहों में विकसित करने के लिए विफल करने में सक्षम हैं. सिग्नल normali को चमक इकाइयों का उपयोग मात्रा निर्धारित है10 ^ 6 या अधिक से अधिक विशिष्ट मूल्यों उपनिवेशवाद का संकेत कर रहे हैं जहां जोखिम समय के लिए ज़ी.
एक दिया संक्रमण के लिए, 24-48 घंटा (चित्रा 2B) से अधिक समय के साथ संकेत बढ़ जाती है. शिखर शुरुआत इंजेक्शन के बाद 36 घंटे के आसपास है, लेकिन समय इस्तेमाल किया जा रहा तनाव और प्लाज्मिड के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. मात्रात्मक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए माउस हर समय ठीक उसी तरह की स्थिति के लिए सुनिश्चित करें.
प्रयोगों के अगले सेट में, बैक्टीरियल biodistrution समय के साथ बैक्टीरिया की वृद्धि (चित्रा 3) को मापने के लिए मात्रा निर्धारित है. ट्यूमर में व्यवहार्य बैक्टीरिया धारावाहिक dilutions (चित्रा 3) में ट्यूमर और चढ़ाना excising और homogenizing द्वारा मात्रा निर्धारित कर रहे हैं. अन्य अंगों को भी इसी तरह से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. ट्यूमर तिल्ली अनुपात बैक्टीरियल विशिष्टता 21, 22 का एक विशिष्ट उपाय है क्योंकि यहाँ, हम, तिल्ली का इस्तेमाल किया है.
ये मायने रखता है हमें बैक्टीरियल आबादी को मापने के लिए अनुमतिसमय के साथ मोर्चे (3B चित्रा). बाईं तरफ, हम बैच संस्कृति प्रयोगों की तुलना में काफी धीमी गति से 1-3 घंटे की एक दुगनी समय, साथ, प्रयोग की अवधि भर में जीवाणुओं की संख्या ट्यूमर में तेजी से बढ़ने देख सकते हैं. यह कम दर की संभावना ट्यूमर वातावरण में गरीब पोषक तत्व की स्थिति की वजह से है. सही में, हम ट्यूमर तिल्ली अनुपात मात्रा निर्धारित है और यह प्रयोग के दौरान बढ़ जाती है कि निरीक्षण किया है. यह निष्कर्ष बैक्टीरिया ट्यूमर में वृद्धि जारी है, जबकि तिल्ली मायने रखता है अनिवार्य रूप से स्थिर हैं कि में, विशिष्टता को दर्शाता है.
चित्रा 1. समग्र प्रयोगात्मक प्रक्रिया के योजनाबद्ध. (A) जीवाणु पूंछ नस में इंजेक्शन और विशेष रूप से ट्यूमर उपनिवेश स्थापित कर रहे हैं. (ख) प्रत्येक समय बिंदु पर, ट्यूमर निकाल रहे हैं,homogenized, और कॉलोनी की गिनती के लिए चढ़ाया. अनुमति 25 के साथ पुनर्प्रकाशित. कॉपीराइट 2012 अमेरिकन केमिकल सोसायटी.
चित्रा 2. पूरे पशु luminescence इमेजिंग IVIS का उपयोग कर. (क) इंजेक्शन खुराक और (ख) समय के साथ बढ़ता सिग्नल. अनुमति 25 के साथ अनुकूलित. कॉपीराइट 2012 अमेरिकन केमिकल सोसायटी.
चित्रा 3. विकास की गतिशीलता को मापने के लिए चढ़ाना और कॉलोनी मायने रखता है. (क) धारावाहिक dilutions के व्यक्तिगत कालोनियों एक प्रतिनिधि तिल्ली नमूना (नीचे) के लिए गिना जा करने की अनुमति. (ख) इन मामलों का अनुसरण करके हम ट्यूमर के अंदर बैक्टीरिया के vivo जनसंख्या उपायों में बना सकते हैं ( ख के रूप में </ मजबूत> तिल्ली का अनुपात) (ग) के साथ और प्लाज्मिड बिना कोशिकाओं की संख्या और ट्यूमर (घ के रूप में). अनुमति 25 के साथ अनुकूलित. कॉपीराइट 2012 अमेरिकन केमिकल सोसायटी.
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Discussion
इस प्रक्रिया का उपयोग करना, हम ट्यूमर बस्तियां जीवाणुओं के विकास और जीन अभिव्यक्ति की गतिशीलता के लिए समय पाठ्यक्रमों उत्पन्न करने में सक्षम हैं. इन मापों नियमित बैच संस्कृति या microfluidics उपकरणों में इन विट्रो में प्रदर्शन कर रहे हैं, वे इन विवो में प्रदर्शन करने के लिए और अधिक कठिन हैं.
इन तरीकों को लागू किया जा सकता है कि कई बदलाव किए गए हैं. हम अपने माउस मॉडल उत्पन्न OVCAR -8 सेल लाइन का इस्तेमाल किया है, जबकि अन्य सेल लाइनों की एक संख्या यों इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, luciferized सेल लाइनों ट्यूमर और बैक्टीरियल luciferase चैनलों की 3 डी colocalization के लिए अनुमति देते हैं कि इस्तेमाल किया जा सकता है. हम एक द्विपक्षीय हिंद पार्श्व मॉडल, एक अलग संख्या और इंजेक्शन स्थलों के स्थानों का इस्तेमाल किया, जबकि इसके अलावा, विभिन्न घटनाओं का अध्ययन करने के लिए मॉडल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, अगर ट्यूमर का आकार एक महत्वपूर्ण चर रहा है, कोशिकाओं के धारावाहिक dilutions तैयार किया जा सकता है और smal पैदा करने, एक साथ अलग अलग साइटों के लिए इंजेक्शनler और बड़े आकार के ट्यूमर. अंत में, हम एस प्रयोग किया जाता है, जबकि साल्मोनेला तनाव ELH430, एस के अन्य उपभेदों साल्मोनेला या ऐसे सी के रूप में अन्य जीवाणुओं इंजेक्शन के लिए बैक्टीरिया की गिनती समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है, हालांकि नोव्यि, ई. कोलाई, वी. cholorae, बी longum, इन तरीकों के साथ यों इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम माउस कैंसर मॉडल का निर्माण, और बैक्टीरिया की तैयारी और इंजेक्शन शामिल है. कैंसर के मॉडल के निर्माण के लिए, सेल गिनती और एकाग्रता, इंजेक्शन की मात्रा, और इंजेक्शन स्थल प्लेसमेंट में सटीक बहुत उत्पन्न ट्यूमर की स्थिरता में वृद्धि होगी. हम यों, आकार के आकार का है, और रखा ट्यूमर सबसे मात्रात्मक तुलनीय डेटा बना पाया है. बैक्टीरिया की तैयारी के लिए, यह पूरी तरह से इंजेक्शन के लिए पहले उन्हें धोने के लिए और ध्यान से बैक्टीरिया एकाग्रता, मात्रा, और इंजेक्शन स्थल के लिए नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है. ये कदम avo करने की आवश्यकता हैइंजेक्शन की आईडी अत्यधिक प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रभाव, और अलग माउस मॉडल के बीच मात्रात्मक तुलना बनाए रखने के लिए. ट्यूमर में प्रवेश कि बैक्टीरिया की संख्या इंजेक्शन खुराक का एक छोटा सा अंश है, चूहों के बीच इंजेक्शन जीवाणुओं की संख्या में बदलाव कॉलोनी प्रगति पर नाटकीय मतभेद हो सकते हैं. अतिरिक्त जानकारी के लिए, vivo अध्ययन 3, 4 में मात्रात्मक लिए बैक्टीरियल तैयारी पर कई अतिरिक्त संदर्भ देखें
इन तकनीकों में विशेष अध्ययन की एक किस्म के लिए अत्यधिक निभा रहे हैं, वहीं कुछ सीमाएं निश्चित करने के लिए आवेदन देने के लिए मौजूद हैं. उदाहरण के लिए, उच्च बैक्टीरिया की गिनती की नसों में प्रसव प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रभाव के कारण कुछ जीवाणु और / या माउस मॉडल के लिए वांछनीय नहीं हो सकता है. प्रशासन का एक वैकल्पिक मार्ग मौखिक वितरण (नलिका - पोषण), जौव 23 पर वर्णित है जो एक तकनीक है. इसके अलावा, समय चूक इमेजिंग काफी श्रम आधारित तकनीक और नवीनता के आधार पर किया जा सकता हैउपलब्ध fic प्रयोग लंबाई, समय संकल्प, और उपकरण. इमेजिंग प्रक्रिया को स्वचालित इन बोझ के कई कम है, लेकिन यह भी नई तकनीकी चुनौतियों का परिचय होगा. ऐसे दिल दर, सांस दर, और तापमान के रूप में माउस नब्ज लगातार अतिरिक्त उपकरणों से निगरानी की जानी चाहिए. साथ ही, लंबी अवधि के संज्ञाहरण के लिए, आंख मलहम पर्याप्त नमी बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. अंत में, माउस के लिए दिया संवेदनाहारी का स्तर लगातार संज्ञाहरण के उचित गहराई बनाए रखने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए. संवेदनाहारी वितरण के साथ माउस महत्वपूर्ण माप है कि एकीकृत एक बंद लूप प्रतिक्रिया नियंत्रण प्रणाली ने इस प्रक्रिया को सुविधाजनक होगा.
सिंथेटिक जीव विज्ञान विवो में आवेदन करने के लिए इंजीनियर जीन सर्किट को लागू करने में ज्यादा सफलता के 17, 19, 20, हासिल की है जबकि डिजाइन सिद्धांतों को सूचित करने के लिए इन विवो समय पाठ्यक्रम में, मात्रात्मक की आवश्यकता होगी. एस साल्मोनेला नैदानिक सिंथेटिक बॉय के लिए एक उत्कृष्ट तनाव हैकैंसर के उपचार के लिए ogy यह ई. के समान है क्योंकि कोली, विशेष रूप से ट्यूमर colonizes, और मानव नैदानिक परीक्षणों 6, 12, 14, 22 में सुरक्षित दिखाया गया है. इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से कई प्रकाशित सर्किट एस में कार्य कर पाया है कि संशोधन 24 बिना साल्मोनेला. यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक मंच का उपयोग करना, हम हाल ही में प्लाज्मिड वैक्टर 25 के निहित अस्थिरता का उपयोग कर प्रोग्राम किया जा सकता है कि कैसे गतिशील विवो अभिव्यक्ति प्रोफाइल में वर्णित है. इसके अलावा, हाल के शोध स्थिरतापूर्वक विवो 23 में प्लाज्मिड वैक्टर बनाए रखने के लिए उपन्यास तरीकों का विकास किया है.
Luciferase इसकी संवेदनशीलता 5 के लिए vivo इमेजिंग में के लिए इस्तेमाल एक आम पत्रकार है, GFP 26 का उपयोग vivo जीन अभिव्यक्ति में मात्रात्मक पर उत्कृष्ट अध्ययन के उदाहरण हैं. GFP का प्रयोग शोधकर्ता विवो में व्यक्तिगत बैक्टीरिया के स्थानिक अस्थायी गतिशीलता का अध्ययन करने की अनुमति होगी.इसके अतिरिक्त, जबकि हम कैंसर के अधिक प्रासंगिक मॉडल की ओर इन पढ़ाई आगे अपने भविष्य कहनेवाला शक्ति 7 में वृद्धि होगी बढ़ा है, एक चमड़े के नीचे मॉडल का इस्तेमाल किया. इस तरह से भविष्य के अध्ययन के नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए विवो सिंथेटिक जीव विज्ञान में से एक अगली पीढ़ी सक्षम हो सकता है.
संगीत कार्यक्रम में दोनों प्रयोगात्मक और कम्प्यूटेशनल तकनीकों का विकास विवो आनुवंशिक सर्किट में इंजीनियरिंग के लिए महत्वपूर्ण होगा. कम्प्यूटेशनल मॉडलिंग तेजी से संभावित outputs का पता लगाने के लिए प्रणाली मानकों की जांच कर सकते हैं, लेकिन प्रासंगिक बने रहने की बारीकी से प्रयोगात्मक परिणामों के लिए बंधे रहना चाहिए. इस प्रकार अब तक, इन परिणामों भाग में vivo में आनुवंशिक सर्किट का अध्ययन करने के लिए तरीकों की कमी के कारण, मात्रात्मक प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो गया है.
इस मंच पर बिल्डिंग, भविष्य अनुप्रयोगों आगे ट्यूमर विशेष उत्तेजनाओं और आत्म विनियमन कार्गो उत्पाद संवेदन, अभिव्यक्ति की गतिशीलता की रेंज का विस्तार है कि इंजीनियर जीन सर्किट में शामिल होगाजरूरत के रूप में आयन. विवो सर्किट बढ़ता में इन की मिलावट के रूप में, मात्रात्मक डेटा पर आवश्यकताओं उन्हें भी वृद्धि होगी धुन करने के लिए जरूरी है. हम लंबे समय तक माउस इमेजिंग में नए नवाचारों के साथ, इस प्रक्रिया को संभव कर देगा, विधि यहाँ वर्णित है कि विश्वास करते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने और संपादन के लिए एच. फ्लेमिंग धन्यवाद. यह काम एक Misrock Postdoctoral फैलोशिप (टीडी) और NDSEG स्नातक फेलोशिप (एपी) द्वारा समर्थित किया गया था. SNB एक HHMI अन्वेषक है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3/10 cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 301629 | |
| RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine | Invitrogen | 11875-119 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | |
| LB Agar Broth | Sigma Aldrich | L2897 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 |
References
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