رقاقة ميكروفلويديك للتحليل الكيميائي للخلايا متعددة الاستخدامات واحدة
Summary
في هذه المقالة نقدم رقاقة ميكروفلويديك لتحليل خلية واحدة. أنه يسمح للالكمي للبروتينات الخلايا، والإنزيمات، العوامل المساعدة، ورسله الثاني عن طريق فحوصات الفلورسنت أو المناعية.
Abstract
نقدم جهاز ميكروفلويديك التي تمكن من تحديد كمية الجزيئات الحيوية داخل الخلايا في الخلايا وحيدة متعددة في نفس الوقت. لهذا الغرض، محاصرون الخلايا بشكل سلبي في منتصف microchamber. عند تفعيل طبقة تحكم، يتم عزل الخلية من حجم المحيطة في غرفة صغيرة. ويمكن بعد ذلك يتم تبادلها حجم المحيطة دون التأثير على الخلايا المعزولة. ومع ذلك، عند فتح وإغلاق قصيرة للغرفة، والحل في غرفة يمكن استبدالها في غضون بضع مئات من ميلي ثانية. ويرجع ذلك إلى العودة إلى الوراء من الغرف، والخلايا يمكن أن يتعرض لها حلول مختلفة بالتتابع بطريقة التحكم الى حد كبير، على سبيل المثال للحضانة، والغسيل، وأخيرا، تحلل الخلية. وmicrochambers مغلقة بإحكام تمكين الاحتفاظ المحللة، وتقليل والسيطرة على التخفيف بعد تحلل الخلية. منذ تحلل والتحليل تحدث في نفس المكان، ويتم الاحتفاظ حساسية عالية لأنه لا يوجد مزيد من دilution أو فقدان التحاليل يحدث أثناء النقل. وبالتالي فإن تصميم microchamber يتيح تحليل موثوق بها وقابلة للتكرار من الأرقام نسخة صغيرة جدا من الجزيئات داخل الخلايا (attomoles، zeptomoles) صدر من الخلايا الفردية. علاوة على ذلك، يمكن ترتيب العديد من microchambers في شكل مجموعة، والسماح للتحليل العديد من الخلايا في آن واحد، نظرا إلى أن تستخدم الأجهزة البصرية مناسبة للرصد. وقد استخدمنا بالفعل منصة لإثبات صحة مفهوم الدراسات لتحليل البروتينات داخل الخلايا، والإنزيمات، العوامل المساعدة والمرسلين الثاني بطريقة قابلة للقياس الكمي إما النسبية أو المطلقة.
Introduction
وقد كشفت العديد من الدراسات في الماضي خلية الى خلية الخلافات بين السكان زنزانة كبيرة 1-3، ولا سيما إشارات العمليات 4، أو مبالغ الجزيئات الحيوية مثل البروتينات داخل الخلايا 5،6، الأيض، والعوامل المساعدة 7،8. وتعتبر هذه التغاير أن يكون أهمية أساسية للتكيف الخلايا والتطور 9، ولكن أيضا أن تلعب دورا رئيسيا في ظهور والعلاج من الأمراض مثل السرطان 10-13. وبالتالي، دراسات على مستوى خلية واحدة هي من الفائدة المرتفعة في الأبحاث البيولوجية والدوائية، وخاصة إذا تكشف هذه الدراسات ردود مختلفة من الخلايا بعد العلاج مع المواد الكيميائية النشطة بيولوجيا.
في السنوات الأخيرة، وقد وضعت العديد من المنصات التحليلية التي تسهل تحليل الخلايا الحية واحدة أو التركيب الكيميائي لمحتوى الخلية. بينما الفلورسنت خلية تنشيط الفرز (FACS) هو الذهب الحادي وANDARD لتحليل الإنتاجية العالية جدا من الخلايا الحية واحدة، وطريقة لا يمكن أن تستخدم لتقدير حجم المركبات داخل الخلايا أو يفرز. وقد وعدت ظهور منصات ميكروفلويديك استراتيجيات تحليلية جديدة لتحديد المواقع، والمعالجة والمراقبة للخلايا واحدة. وتم التوصل إلى علامة فارقة في على microfluidics مع دمج PDMS مرن الصمامات التي حققتها الزلزال وزملاء العمل 14،15. هذه الصمامات هي مفيدة لأنها يمكن عزل مناطق في الرقاقة، مثل فصل ثقافتين 16. علاوة على ذلك، كانت قابلة للتطبيق وخاصة بالنسبة للتحليل خلية واحدة، وبالتالي يساعد على تقليل المشاكل التخفيف تحليلها. قوة هذا النهج للتحليل وحيدة الخلية وقد تجلى مؤخرا من قبل هانسن وزملاء العمل، الذي حلل التعبير الجيني من مئات الخلايا واحد في نفس الوقت 17.
عند استهداف البروتينات ونواتج الأيض، وتحليل أمر صعب جدا نظرا لعدم وجود مناسبةطرق mplification، وعدد كبير من مركبات مختلفة الحاضر، والاختلافات في الطبيعة الكيميائية. علاوة على ذلك، من المتوقع أن تكون موجودة بأعداد نسخة منخفضة في حدود بضع عشرة آلاف الجزيئات الحيوية داخل الخلايا 18 الأكثر، وبالتالي الطريقة التحليلية المستخدمة يجب أن يكون لديك حساسية عالية. فحوصات أكثر قوة مثل المناعية والمناعية انزيم مرتبط (ELISA) يصعب على الاندماج في الأجهزة ميكروفلويديك لأنها تتطلب العديد من الخطوات الغسيل والحضانة وكذلك تجميد السطح.
نظرا لهذه التحديات، فإنه ليس من المستغرب أن تم الإبلاغ سوى أمثلة قليلة حيث تم كميا البروتينات او نواتج على مستوى خلية واحدة. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن دراسات على إفراز مركبات الفلورسنت 19،20. في الآونة الأخيرة، وقدم مع تنفيذ ELISA لتحليل يفرز (nonfluorescent) البروتينات من ثقافة الخلية (الخلايا THP-1) 21 واحد (طمناعية) الخلايا 10. استهداف البروتينات داخل الخلايا، شي وآخرون. تطوير جهاز ميكروفلويديك التي سهلت تحديد البروتينات داخل الخلايا لتحليل مسارات الإشارات في الخلايا السرطانية عن طريق والمناعية 11. ومع ذلك، تم تحديد كميات النسبية فقط من البروتينات، وكان يستخدم أي التضخيم الأنزيمية لزيادة إشارة للبروتينات وفرة منخفضة.
في الآونة الأخيرة، كنا قادرين على الجمع بين محاصرة microdevice وحيدة الخلية مع المقايسات المناعية مضان 8 و 22 (الشكل 1). محاصرون الخلايا بشكل سلبي في الهياكل عقبة microsized، والتي تسمح العرض والصرف (السريع) من العوامل الكيميائية الأخرى المتوسطة ودون أي حركة الخلايا. صمام على شكل حلقة حول كل فخ يمكن عزل الخلية في حجم صغير جدا ("وmicrochamber"). وهذا صمام دفعتها مباشرة بعد إدخال عازلة الخلايا lysing (hypoosmolar)، وقال انهالامتحانات التنافسية الوطنية ومنع الجزيئات داخل الخلايا أو الجزيئات يفرز لنزع فتيل بعيدا. الأهم من ذلك، ونظرا لصغر حجم وحدة التخزين (625 رر) يتم تجنب تخفيف كبير من الجزيئات. علاوة على ذلك، منذ يتم تنفيذ تحلل والتحليل في في نفس الموقف في رقاقة، ليست هناك خسارة من analytes بسبب النقل. تصميم رقاقة الموصوفة هنا تضم 8 صفوف بالتناوب إما 7 أو 8 microchambers، بلغ مجموعها 60 microchambers. ودفعتها في غرف الصفوف، بحيث تنتفي صفة انتقال التلوث على طول الخط.
منصة يمكن استخدامها في تركيبة مع المقايسات مضان فضلا عن المقايسات المناعية (الشكل 1D). لهذا الأخير، أنشأنا بروتوكولات لتجميد الأجسام المضادة، التي تتوافق مع إنتاج رقاقة وعملية التجميع. وبالتالي منصة يفتح الطريق لفحوصات حساسة وموثوقة وقابلة للقياس الكمي على مستوى خلية واحدة. حتى الآن، وقد استخدمنا جهاز لتحليل طالانزيمات ntracellular ويفرز (الكمي النسبي الذي المقايسات الأنزيمية)، العوامل المساعدة داخل الخلايا والبروتينات والجزيئات الصغيرة (الكمي المطلق من قبل المقايسات نقطة النهاية أو ELISA). في ما يلي، ونحن تصف عملية تصنيع رقاقة عن طريق الطباعة الحجرية الناعمة متعدد الطبقات وبروتوكولات لالزخرفة من الأجسام المضادة عن طريق microcontact الطباعة والكيمياء السطح. بالإضافة إلى ذلك، يتم إعطاء بعض الأمثلة على استخدام رقاقة والعمليات.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد فتحت التكنولوجيا على microfluidics إمكانيات جديدة ورائعة للتحليل وحيدة الخلية. على وجه الخصوص، وإمكانية اعتراض وشل الخلايا بشكل فردي عن طريق أدوات ميكروفلويديك سمحت دراسات منهجية على المدى القصير والطويل على خصائص وحيدة الخلية والاستجابة لها. بالإضافة إلى ذلك، التغل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
والكتاب الامتنان توم روبنسون للقراءة دليل على المخطوطة، C. BÄRTSCHI وH. بنز لبناء نظام مراقبة ضغط مبنية خصيصا. نود أيضا أن نعترف استخدام مركز المجهر الضوئي (LMC)، وكلاهما في ETH زيورخ أول مرفق غرفة نظيفة و. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل شركة ميرك سيرونو ومجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج الإطار 7 (ERC ابتداء غرانت، المشروع رقم 203428، nμLIPIDs).
Materials
| REAGENTS: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| SU-8 2015 | MicroChem Corp. (Netwon, MA) | n.a. | |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane | ABCR (Karlsruhe, Germany) | AB103608 | |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate | Sigma Aldrich | M9763 | |
| Acetone | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 100014 | |
| Avidin | AppliChem (Axon Lab AG) | A-2568 | |
| AZ 1518 | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| AZ 726 developer | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A-4503 | |
| Bovine serum albumin, biotin | Sigma Aldrich | A-8549 | |
| Cell dissociation buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Hexamethyldisilazane (HDMS) | Sigma Aldrich | 40215 | |
| Hydrochloric acid | Fluka | 84422 | |
| Isopropanol | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fluka | 63068 | |
| MR developer 600 | Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) | n.a. | |
| PBS | Invitrogen | 10010-031 | |
| PLL-g-PEG grafted | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| PLL-g-PEG grafted biotin | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| Potassium chloride | Fluka | 60132 | |
| Protein G, biotin | Sigma Fine Chemicals | 41624 | |
| Silicon wafer | Si-Mat (Kaufering, Germany) | n.a. | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 39100000 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Biorad | 1610716 | |
| Tween 20 | Biorad | 1706531 | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| 0.22 µm PES syringe filter | TRP | 99722 | |
| 1/1.5 mm biopsy puncher | Miltex, York PA | 33-31AA/33-31A | |
| Cell Trics filter 20 µm | Partec | 04-004-2325 | |
| Centrifuge Sigma 3-18K | Kuehner | n.a. | |
| Hotplate HP 160 III BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| MA-6 mask aligner | Karl Suess | n.a. | |
| Multizoom AZ100M microscope | Nikon Corporation | n.a. | |
| Photomask | Microlitho, Essex, U.K. | n.a | |
| Plasma Cleaner PDC-32G | Harrick | n.a. | |
| Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell | n.a. | |
| Spin Modules SM 180 BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| Step profiler Dektak XT Advanced | Bruker | n.a. | |
| Syringe pump neMESYS | Cetoni | n.a. |
References
- Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
- Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
- Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
- Faley, S., Seale, K., et al. Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel. Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).
- Huang, B., Wu, H., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).
- Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis. Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).
- Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules. Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).
- Agresti, J. J., Antipov, E., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).
- Ma, C., Fan, R., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).
- Shi, Q., Qin, L., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines. PLoS ONE. 7 (5), e33788 (2012).
- Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. Epithelial cell polarity, stem cells and cancer. Nature. 12 (1), 23-38 (2012).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
- Gao, Y., Majumdar, D., et al. A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology. Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).
- White, A. K., VanInsberghe, M., et al. High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).
- Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).
- Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. Towards real time analysis of protein secretion from single cells. Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).
- Huang, Y., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).
- Huang, N. T., Chen, W., et al. An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping. Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 .
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).
- Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress. EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).
