단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩
Summary
이 문서에서 우리는 단일 세포 분석을위한 마이크로 유체 칩을 제시한다. 그것은 수있는 세포 내 단백질, 효소, 조효소, 형광 분석이나 면역에 의해 두 번째 메신저의 정량화.
Abstract
우리는 병렬로 복수의 단일 세포에서 세포 내 생체 분자의 정량적 측정을 가능하게하는 미세 유체 장치를 제시한다. 이를 위해, 세포는 수동적 microchamber의 중간에 갇혀있다. 제어 층의 활성화시에, 셀은 작은 챔버에서 주변 볼륨으로부터 분리된다. 주변 음량은 고립 셀에 영향을주지 않고 교환 될 수있다. 그러나, 챔버의 짧은 개방 및 폐쇄시에, 챔버 내 용액을 몇 백 밀리 초 내에서 대체 될 수있다. 때문에 실의 가역성에, 세포 배양, 세척, 및 최종적으로, 세포 용해 예 : 고도로 제어 가능한 방식으로 다른 솔루션을 순차적으로 노출 할 수있다. 단단히 밀봉 microchambers은 해물의 유지를 가능하게 최소화하고 세포 용해 후 희석을 제어 할 수 있습니다. 용해 및 분석은 동일한 위치에서 발생하기 때문에, 고감도가 유지되어 더 이상의 D보기 때문에분석의 ilution 또는 손실이 운송 중에 발생합니다. microchamber 디자인 따라서 각각의 세포에서 방출 세포 내 분자 (아토 몰, zeptomoles)의 매우 작은 크기의 숫자의 신뢰성과 재현성 분석을 가능하게한다. 또한, 많은 microchambers 적합한 광학 기기가 모니터링을 위해 사용되는 관련 한번에 많은 세포의 분석을 가능하게 배열 형식으로 배열 될 수있다. 우리는 이미 세포 내 단백질, 효소, 보조 인자 및 상대 또는 절대 하나를 정량화 할 수있는 방법으로 두 번째 메신저를 분석하기 위해 개념 증명 연구를위한 플랫폼을 사용하고 있습니다.
Introduction
과거의 많은 연구는 세포에 세포 대 세포 인구 1-3 이내의 차이, 특히 신호 4를 처리, 또는 단백질 5,6, 대사 및 보조 인자 7,8 세포 내 생체 분자의 양을 제시했습니다. 이러한 이질성은 세포의 적응과 진화 9 근본적으로 중요 할뿐만 아니라, 암과 10-13과 같은 질병의 출현 및 치료에 중요한 역할을하는 것으로 간주됩니다. 따라서, 단일 세포 수준에서의 연구는 이러한 연구는 생리 활성 화학 물질로 처리 한 후 다른 세포 반응을 표시하는 경우 특히, 생물학적, 약리학 적 연구에 높은 관심이다.
최근, 많은 분석 플랫폼은 하나의 살아있는 세포의 분석이나 세포 함량의 화학 성분을 용이하게 개발되었다. 형광 활성 세포 정렬 (FACS)는 금 성 동안andard 단일 살아있는 세포의 매우 높은 처리량 분석을 위해,이 방법은 세포 내 또는 분비 화합물의 정량에 이용 될 수 없다. 미세 유체 플랫폼의 출현 위치, 치료 및 단일 세포의 관찰에 대한 새로운 분석 전략을 약속했다. 미세 유체의 이정표가 지진 및 동료 (14, 15)에 의해 실현 유연한 PDMS 밸브의 통합에 도달 하였다. 그들은 칩 영역을 분리 할 수 있기 때문에이 밸브가 유용합니다, 예를 들어, 두 문화 (16)를 분리합니다. 게다가, 그들은 단일 세포 분석에 특히 적용 가능하며, 따라서 분석 희석의 문제를 줄일. 단일 세포 분석을위한이 방법의 파워는 최근 한센 평행 17 단셀 수백 개 유전자 발현을 분석하는 동료에 의해 입증되었다.
단백질 및 대사 산물을 대상으로하는 경우, 분석 인해 최적의 부족으로 아주 어렵다mplification 방법, 다른 본 발명의 화합물 및 화학 특성에서의 변화의 큰 수입니다. 또한, 대부분의 세포 내 생체 분자가 몇 가지 수만 18의 순서로 낮은 사본 번호에 존재하는 것으로 예상된다, 따라서 사용 된 분석 방법은 높은 감도를 가지고 있어야합니다. 이러한 면역 효소 결합 면역 분석법 (ELISA)와 같은보다 강력한 분석은 여러 세척 및 배양 단계뿐만 아니라 표면의 고정을 필요로하기 때문에 마이크로 유체 장치에 통합하기가 어렵습니다.
때문에 이러한 문제로, 그것은 단백질 또는 대사 산물이 단일 세포 수준에서 정량화 된 곳에서만 몇 가지 예는보고 된 것은 놀라운 일이 아니다. 예를 들어, 형광 화합물의 분비 연구 19,20보고되었다. 최근, ELISA와 구현은 세포 배양에서 분비 (비 형광) 단백질 (THP-1 세포) (21)와 하나의 (난의 분석을 제시했다mmune) 세포 10. 세포 내 단백질을 표적시 등이. 면역 측정법 (11)의 수단에 의해 종양 세포에서의 신호 전달 경로의 분석을위한 세포 내 단백질의 식별을 용이하게 미세 유동 장치를 개발했다. 그러나, 단백질의 단지 상대적인 양을 결정하고, 어떤 효소 증폭 낮은 풍부한 단백질에 대한 신호를 증가하는 데 사용되지 않았다.
최근에는 형광 분석법 (8) 및 면역 분석 (22)와 단일 셀 트래핑 마이크로 디바이스 (도 1)에 결합 할 수 있었다. 세포는 수동적으로 공급하고 세포의 움직임이없는 매체 및 기타 화학 물질의 (빠른) 교환을 할 수 microsized 장애물 구조에 갇혀있다. 각 트랩의 주위에 고리 모양의 밸브는 매우 작은 양 ( "microchamber")에서 세포의 분리를 가능하게한다. 이 밸브는 바로 그가, 세포 용균 (hypoosmolar) 버퍼를 도입 한 후 작동되는NCE 멀리 확산 세포 내 분자 또는 분자의 분비를 방지한다. 가장 중요한 점으로 인해 부피 (625 PL)의 작은 사이즈에 분자의 대규모 희석은 회피된다. 용해 및 분석을 칩의 동일 위치에서 수행되기 때문에 한층, 운송에 의한 분석 물질의 손실이 없다. 여기에 설명 된 칩 설계는 60 microchambers 총 7,8 어느 microchambers 13 교번 행을 포함한다. 라인을 따라 교차 오염이 배제되도록 챔버, 행에 작동된다.
플랫폼은 형광 분석법뿐만 아니라 면역 분석법 (도 1D)와 조합하여 사용할 수있다. 후자의 경우에, 우리는 칩 생산 및 조립 공정과 호환되는 항체의 고정화를위한 프로토콜을 확립. 따라서 플랫폼은 단일 세포 수준에서, 중요한 신뢰성과 정량 분석을위한 길을 엽니 다. 지금까지, 우리는 I의 분석 장치를 사용했다ntracellular 분비 효소 (효소 분석에 의해 상대 정량), 세포 내 보조 인자, 단백질과 작은 분자 (엔드 포인트 분석 또는 ELISA에 의한 절대 정량). 이하에서, 우리는 마이크로 콘택트 프린팅 및 표면 화학에 의해 다층 소프트 리소그래피 및 항체의 패터닝을위한 프로토콜에 의해 칩의 제조 공정을 설명한다. 또한, 칩의 사용과 작업의 몇 가지 예는 제공됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
미세 유체 기술은 단일 세포 분석을위한 새로운 매혹적인 가능성을 열었습니다. 특히, 트랩 가능성 및 미세 도구를 사용하여 개별적으로 세포를 고정화는 단일 셀의 속성과 응답에 대한 체계적인 장단기 연구를 허용했다. 또한, 마이크로 칩에서 생성 고주파 미세 방울, 셀의 캡슐화는, 통상적 계측법 장치로 수행 할 수없는 단일 세포 분비 연구를 사용할 수있다. 의 microdroplet 방법은, 그러나, 배양…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기꺼이 원고, 맞춤형 압력 제어 시스템의 건설을위한 C. Bärtschi 및 H. 벤츠의 증거 독서 톰 로빈슨을 인정합니다. 우리는 또한 클린 룸 시설 FIRST 두 ETH 취리히에서 빛을 현미경 센터 (LMC)의 사용을 인정하고 싶습니다. 작품은 7 번째 프레임 워크 프로그램 (ERC 그랜트를 시작, 프로젝트 없음. 203428, nμLIPIDs)에서 머크 세로 노, 유럽 연구위원회 (ERC)에 의해 투자되었다.
Materials
| REAGENTS: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| SU-8 2015 | MicroChem Corp. (Netwon, MA) | n.a. | |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane | ABCR (Karlsruhe, Germany) | AB103608 | |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate | Sigma Aldrich | M9763 | |
| Acetone | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 100014 | |
| Avidin | AppliChem (Axon Lab AG) | A-2568 | |
| AZ 1518 | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| AZ 726 developer | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A-4503 | |
| Bovine serum albumin, biotin | Sigma Aldrich | A-8549 | |
| Cell dissociation buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Hexamethyldisilazane (HDMS) | Sigma Aldrich | 40215 | |
| Hydrochloric acid | Fluka | 84422 | |
| Isopropanol | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fluka | 63068 | |
| MR developer 600 | Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) | n.a. | |
| PBS | Invitrogen | 10010-031 | |
| PLL-g-PEG grafted | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| PLL-g-PEG grafted biotin | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| Potassium chloride | Fluka | 60132 | |
| Protein G, biotin | Sigma Fine Chemicals | 41624 | |
| Silicon wafer | Si-Mat (Kaufering, Germany) | n.a. | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 39100000 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Biorad | 1610716 | |
| Tween 20 | Biorad | 1706531 | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| 0.22 µm PES syringe filter | TRP | 99722 | |
| 1/1.5 mm biopsy puncher | Miltex, York PA | 33-31AA/33-31A | |
| Cell Trics filter 20 µm | Partec | 04-004-2325 | |
| Centrifuge Sigma 3-18K | Kuehner | n.a. | |
| Hotplate HP 160 III BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| MA-6 mask aligner | Karl Suess | n.a. | |
| Multizoom AZ100M microscope | Nikon Corporation | n.a. | |
| Photomask | Microlitho, Essex, U.K. | n.a | |
| Plasma Cleaner PDC-32G | Harrick | n.a. | |
| Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell | n.a. | |
| Spin Modules SM 180 BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| Step profiler Dektak XT Advanced | Bruker | n.a. | |
| Syringe pump neMESYS | Cetoni | n.a. |
References
- Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
- Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
- Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
- Faley, S., Seale, K., et al. Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel. Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).
- Huang, B., Wu, H., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).
- Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis. Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).
- Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules. Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).
- Agresti, J. J., Antipov, E., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).
- Ma, C., Fan, R., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).
- Shi, Q., Qin, L., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines. PLoS ONE. 7 (5), e33788 (2012).
- Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. Epithelial cell polarity, stem cells and cancer. Nature. 12 (1), 23-38 (2012).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
- Gao, Y., Majumdar, D., et al. A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology. Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).
- White, A. K., VanInsberghe, M., et al. High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).
- Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).
- Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. Towards real time analysis of protein secretion from single cells. Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).
- Huang, Y., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).
- Huang, N. T., Chen, W., et al. An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping. Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 .
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).
- Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress. EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).
