Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

Summary

En este artículo se presenta un chip de microfluidos para el análisis de células individuales. Permite la cuantificación de las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores, y segundos mensajeros por medio de ensayos fluorescentes o inmunoensayos.

Abstract

Se presenta un dispositivo de microfluidos que permite la determinación cuantitativa de biomoléculas intracelulares en múltiples células individuales en paralelo. Para este propósito, las células están atrapados pasivamente en el medio de una microcámara. Tras la activación de la capa de control, la célula se aísla del volumen que rodea en una pequeña cámara. El volumen que rodea a continuación, puede ser intercambiado sin afectar a la célula aislada. Sin embargo, al abrirse corta y cierre de la cámara, la solución en la cámara puede ser sustituido dentro de unos pocos cientos de milisegundos. Debido a la reversibilidad de las cámaras, las células pueden ser expuestos a diferentes soluciones secuencialmente de una manera altamente controlable, por ejemplo, para la incubación, el lavado, y finalmente, la lisis celular. Las microcámaras bien cerrados permiten la retención del lisado, minimizar y controlar la dilución después de la lisis celular. Desde la lisis y el análisis se producen en el mismo lugar, se retiene una alta sensibilidad porque no más lejos dilution o pérdida de los analitos se produce durante el transporte. Por tanto, el diseño microcámara permite el análisis fiable y reproducible de un número muy reducido de copias de moléculas intracelulares (attomoles, zeptomoles) liberadas por las células individuales. Además, muchos microcámaras pueden estar dispuestos en un formato de matriz, permitiendo el análisis de muchas células a la vez, dado que los instrumentos ópticos adecuados se utilizan para el seguimiento. Ya hemos utilizado la plataforma para los estudios de prueba de concepto para analizar las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores y segundos mensajeros en forma cuantificable, ya sea relativa o absoluta.

Introduction

Muchos estudios en el pasado han revelado diferencias entre células dentro de una población de células grandes ^1-3, en particular, la señalización de los procesos ^4, o las cantidades de biomoléculas intracelulares tales como proteínas, metabolitos, ^5,6 y ^7,8 cofactores. Estas heterogeneidades se considera que son de importancia fundamental para la adaptación celular y la evolución ^9, sino que también juegan un papel clave en la aparición y el tratamiento de enfermedades como el cáncer ^10-13. Por lo tanto, los estudios sobre el nivel de una sola célula son de gran interés en la investigación biológica y farmacológica, en particular si estos estudios revelan las diferentes respuestas de las células después del tratamiento con sustancias químicas bioactivas.

En los últimos años, muchas plataformas analíticas se han desarrollado que facilitan el análisis de células vivas individuales o la composición química del contenido de la celda. Mientras que células activadas por fluorescencia (FACS) es el oro StAndard para el análisis de muy alto rendimiento de células vivas individuales, el método no puede ser empleado para la cuantificación de compuestos intracelulares o secretadas. La aparición de plataformas de microfluidos ha prometido estrategias analíticas novedosas para el posicionamiento, el tratamiento y la observación de las células individuales. Un hito en la microfluídica se alcanzó con la integración de las válvulas de PDMS flexibles realizadas por Quake y compañeros de trabajo ^14,15. Estas válvulas son útiles ya que pueden aislar a las regiones en el chip, por ejemplo, separar dos culturas ^16. Además, son especialmente aplicable para el análisis de células individuales y, por tanto, ayudan a reducir los problemas de dilución del analito. La potencia de este enfoque para el análisis de una sola célula se ha demostrado recientemente por Hansen y compañeros de trabajo, que analizaron la expresión de genes de cientos de células individuales en paralelo ^17.

Cuando el objetivo proteínas y metabolitos, el análisis es muy difícil debido a la falta de un adecuadométodos mplification, el gran número de diferentes compuestos presentes, y sus variaciones en la naturaleza química. Además, se espera que la mayoría de biomoléculas intracelulares a estar presentes en bajo número de copias en el orden de unos pocos diez miles ^18, por lo tanto, el método analítico utilizado debe tener una alta sensibilidad. Ensayos más potentes, como los inmunoensayos y los inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA) son difíciles de integrar en los dispositivos de microfluidos, ya que requieren varios pasos de lavado y de incubación, así como la inmovilización de superficie.

Debido a estos desafíos, no es sorprendente que sólo unos pocos ejemplos han sido reportados donde las proteínas o metabolitos se cuantificaron en el nivel de una sola célula. Por ejemplo, los estudios sobre la secreción de compuestos fluorescentes han sido reportados ^19,20. Recientemente, la aplicación con ELISA se presentó para el análisis de secretadas (no fluorescentes) proteínas a partir de un cultivo de células (THP-1 células) ²¹ y solo (immune) células ^10. Orientación de las proteínas intracelulares, Shi et al. Desarrolló un dispositivo de microfluidos que facilitó la identificación de proteínas intracelulares para el análisis de las vías de señalización en las células tumorales por medio de un inmunoensayo ^11. Sin embargo, se determinaron sólo cantidades relativas de las proteínas y no hay amplificación enzimática se utilizan para aumentar la señal para las proteínas de baja abundancia.

Recientemente, hemos sido capaces de combinar un microdispositivo captura de una sola célula con ensayos de fluorescencia ⁸ e inmunoensayos ²² (Figura 1). Las células están atrapados pasivamente en las estructuras de vallas micronizada, que permiten el suministro y el intercambio (rápida) de medio y otros agentes químicos sin ningún movimiento de las células. Una válvula en forma de anillo alrededor de cada trampa permite el aislamiento de la célula en un volumen muy pequeño ("la microcámara"). Esta válvula se acciona inmediatamente después de la introducción de un tampón de lisis celular (hipoosmolar), sena vez que la prevención de moléculas intracelulares o moléculas secretadas a difundir lejos. Lo más importante, debido al pequeño tamaño del volumen (625 PL) se evita gran dilución de las moléculas. Además, puesto que la lisis y análisis se llevan a cabo en en la misma posición en el chip, no hay pérdida de analitos debido al transporte. El diseño de chips descrito aquí tiene 8 filas alternas de 7 ó 8 microcámaras, por un total de 60 microcámaras. Las cámaras son accionados en filas, de manera que se impide la contaminación cruzada a lo largo de una línea.

La plataforma se puede utilizar en combinación con ensayos de fluorescencia, así como ensayos inmunológicos (Figura 1D). Para este último, hemos establecido protocolos para la inmovilización de los anticuerpos, que son compatibles con la producción de chips y proceso de montaje. De ahí que la plataforma se abre el camino para ensayos sensibles, fiables y cuantificables a nivel de células individuales. Hasta ahora, se ha utilizado el dispositivo para el análisis de la ienzimas ntracellular y secretadas (cuantificación relativa mediante ensayos enzimáticos), cofactores intracelulares, proteínas y pequeñas moléculas (cuantificación absoluta por ensayos de punto final o ELISA). En lo que sigue, se describe el proceso de fabricación de chips por medio de litografía blanda de múltiples capas y los protocolos para los patrones de los anticuerpos por medio de la impresión por microcontacto y química de superficie. Además, se dan algunos ejemplos de uso de chips y las operaciones.

Protocol

1. SU-8 de fabricación Maestro Preparar dos moldes maestros para los canales (de fluidos y control, para esquemas y dimensiones ver Figura 2) con el siguiente protocolo pero con diferentes patrones de máscara. El proceso se muestra en la Figura 3a. Comience por calentamiento de una oblea de silicio de 4 pulgadas por 10 min a 180 ° C. Cargue la oblea deshidratado en un spin-revestidor y utilizar el siguiente protocolo para spin-coating SU-8 2015: <…

Representative Results

Nuestra plataforma es capaz de analizar una variedad de intracelular, así como moléculas secretadas presentes en o producidos por células individuales. Aquí, nos gustaría presentar diferentes estudios ejemplo para subrayar la variedad de posibles ensayos. Daremos un ejemplo para una enzima secretada (Figura 5a), así como una enzima intracelular (Figura 5b) y proteína (Figuras 5C y D). Para más ejemplos, como cofactores o pequeñas moléculas, co…

Discussion

Tecnología microfluídica ha abierto nuevas y fascinantes posibilidades para el análisis de una sola célula. En particular, la posibilidad de atrapar e inmovilizar las células individualmente por herramientas microfluídicos ha permitido estudios sistemáticos a corto y largo plazo sobre las propiedades de una sola célula y la respuesta. Además, la encapsulación de células en microgotas de alta frecuencia, generados en un microchip, ha permitido estudios de secreción de células individuales, que no se pueden r…

Materials

REAGENTS:
Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
SU-8 2015	MicroChem Corp. (Netwon, MA)	n.a.
1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane	ABCR (Karlsruhe, Germany)	AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate	Sigma Aldrich	M9763
Acetone	Merck VWR (Darmstadt, Germany)	100014
Avidin	AppliChem (Axon Lab AG)	A-2568
AZ 1518	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)	n.a.
AZ 726 developer	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)	n.a.
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A-4503
Bovine serum albumin, biotin	Sigma Aldrich	A-8549
Cell dissociation buffer	Invitrogen	13151-014
Hexamethyldisilazane (HDMS)	Sigma Aldrich	40215
Hydrochloric acid	Fluka	84422
Isopropanol	Merck VWR (Darmstadt, Germany)	109634
Magnesium chloride hexahydrate	Fluka	63068
MR developer 600	Microresist technology GmbH (Berlin, Germany)	n.a.
PBS	Invitrogen	10010-031
PLL-g-PEG grafted	SuSoS, (Dübendorf, Switzerland)	n.a.
PLL-g-PEG grafted biotin	SuSoS, (Dübendorf, Switzerland)	n.a.
Potassium chloride	Fluka	60132
Protein G, biotin	Sigma Fine Chemicals	41624
Silicon wafer	Si-Mat (Kaufering, Germany)	n.a.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow Corning	39100000
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Biorad	1610716
Tween 20	Biorad	1706531
EQUIPMENT:
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
0.22 µm PES syringe filter	TRP	99722
1/1.5 mm biopsy puncher	Miltex, York PA	33-31AA/33-31A
Cell Trics filter 20 µm	Partec	04-004-2325
Centrifuge Sigma 3-18K	Kuehner	n.a.
Hotplate HP 160 III BM	Sawatec, Sax, Switzerland	n.a.
MA-6 mask aligner	Karl Suess	n.a.
Multizoom AZ100M microscope	Nikon Corporation	n.a.
Photomask	Microlitho, Essex, U.K.	n.a
Plasma Cleaner PDC-32G	Harrick	n.a.
Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE	Laurell	n.a.
Spin Modules SM 180 BM	Sawatec, Sax, Switzerland	n.a.
Step profiler Dektak XT Advanced	Bruker	n.a.
Syringe pump neMESYS	Cetoni	n.a.