Live cell imaging van Alphaherpes Virus Anterograad Transport en Spread
Summary
Live cell imaging van alphaherpes virusinfecties maakt analyse van de dynamische gebeurtenissen van gerichte transport en intercellulaire verspreiding. Hier presenteren we methodieken die recombinante virale stammen die fluorescerende fusie-eiwitten tot visualisatie van virale assemblages tijdens infectie van primaire neuronen te faciliteren.
Abstract
Vooruitgang in levende cellen fluorescentie microscopie technieken, alsmede de constructie van recombinante virale stammen die fluorescerende fusie-eiwitten tot expressie zijn real-time visualisatie van transport en verspreiding van alphaherpes virusinfectie van neuronen geactiveerd. Het nut van nieuwe fluorescente fusie-eiwitten om virale membraan, tegument en capsids, in combinatie met live cell imaging, geïdentificeerd virusdeeltje assemblages ondergaan vervoer binnen axonen. Dergelijk gereedschap zijn met succes toegepast voor analyse van cel-cel verspreiding van virale deeltjes naar het aantal en de diversiteit van virions overgedragen tussen cellen te kwantificeren. Belangrijk is dat de technieken van live cell imaging van anterograde transport en verspreiding produceren een schat aan informatie, waaronder deeltjes-transport snelheden, verdelingen van deeltjes, en temporele analyses van eiwit lokalisatie. Naast klassieke virale genetische technieken, zijn deze methodieken verstrekt kritische inzichtenin belangrijke mechanistische vragen. In dit artikel beschrijven we in detail de beeldvormende methoden die werden ontwikkeld om de fundamentele vragen van alphaherpes virus transport en de verspreiding beantwoorden.
Introduction
Infectie van het perifere zenuwstelsel (PNS) van alphaherpes virussen zoals herpes simplex virus (HSV) -1, -2, en pseudorabies virus (PRV) omvat verschillende complexe en sterk gereguleerde stappen in de virale levenscyclus. Vervoer binnen neuronen van de PNS is cruciaal tijdens de gebeurtenissen van zowel de primaire virale infectie en daaropvolgende inter-host-spread. De moleculaire mechanismen die twee componenten van de virale levenscyclus moduleren; gericht transport van virale assemblages weg van cellichamen binnen axonen (anterograde transport) en de daaropvolgende overdracht van virusdeeltjes aan gevoelige cellen (anterograde spread) zijn van belang om inzicht te herpesvirus pathogenese.
Het transport en wegtrekken van virale deeltjes in neuronen afhankelijk montage van een volwassen infectieus virion 1,2. Eerder vaste assays, zoals immunofluorescentie (IF) en elektronenmicroscopie (EM), werden gebruikt om het deeltje samenstel staat en prot bestuderenein interacties in verband met het vervoer virion en verspreiden 3-6. Maar het dynamische karakter van het vervoer virionen en experimentele artefacten geïntroduceerd door chemische fixatie overtuigde de interpretatie van vaste beelden 7,8. Recent zijn een aantal virale fluorescerende fusie-eiwitten is beschreven voor HSV en PRV die verwaarloosbaar effect op proteïne functie. Green Fluorescent Protein (GFP) en rood fluorescerende eiwitten (mCherry of mRFP) fluoroforen worden vaak gekoppeld aan beeldvorming van twee van de drie structurele componenten van een rijpe virion toe: capside, tegument en glycoproteïne 9-11. Live cell imaging van anterograde vervoer met behulp van dual-gelabelde virussen visualiseert de assemblage staat van virale deeltjes tijdens het transport. Soortgelijke fluorofoor expressie virale stammen worden gebruikt om het aantal en de verscheidenheid van virale genomen na verspreiding 12,13 visualiseren. De eigenschappen van de fluorescerende eiwitten (beoordeeld in 14,15) grote invloedhet vermogen om virale of cellulaire samenstellingen visualiseren. De intrinsieke eigenschappen van de fluorescente eiwit, waaronder zelf-interacties en stabiliteit moet worden beschouwd bij het ontwerpen en testen van nieuwe proteïne fusies voor het behoud van wildtype functionaliteit.
In combinatie met fluorescerende eiwitfusies, twee goed gekarakteriseerd in vitro celkweek systemen worden ingezet voor live cell imaging van herpes virus infectie: los 16 en gecompartimenteerd 17 (Figuur 1A) rat superieure cervicale ganglia (SCG) neuronen. In beide systemen, embryonale SCG's worden ontleed, gedissocieerd om eencellige organismen, en vergulde voor in vitro kweken van 18. SCG neuronen zijn onderdeel van het autonome zenuwstelsel en kunnen gemakkelijk worden gekweekt en gedifferentieerd neuronale groeifactor (NGF) tot een volwassen gepolariseerde toestand ex vivo. Gedissocieerd SCG neuronen vormen een uitgebreid netwerk van axonen die f maaktof visualisatie van virale deeltjes onderworpen worden anterograde transport 6. Verzuilde SCG culturen bieden fluïdische isolement van de neuronale cel lichaam (S compartiment) en distale axon-uiteinden (N compartiment) 19. Een aantal gedetailleerde protocollen voor de aanleg en het gebruik van verzuilde neuronen met behulp van originele 20 of gemodificeerde Campenot kamers 17 eerder openbaar werden gemaakt. Vloeibare isolatie zorgt voor selectieve infectie van neuronale cellichamen en detectie van nieuwe virusdeeltjes na vervoer naar afgelegen axon-uiteinden. Plating epitheelcellen over de uiteinden voorafgaand aan infectie biedt ontvangende cellen voor verspreiding van de virale infectie.
Er zijn vele essentiële elementen van belang voor alle live cell imaging experimenten, maar het meest relevant zijn voor onze protocollen zijn: automatische beeldopname, tl verlichting, snelheid van de beeldvorming, en milieu-controle. Voor alle grafische experimenten, gebruiken weeen omgekeerde, geautomatiseerd epifluorescentie microscoop verlichting (Figuur 1B). De microscoop is opgebouwd rond de Nikon Eclipse Ti basis en maakt gebruik van een aantal computergestuurde gemotoriseerde systemen om snel opnieuw configureren van de microscoop tijdens automatische beeldopname. Voor fluorescentie verlichting, maken we gebruik van een breed-spectrum kwik booglamp die verzwakt met grijsfilters langs het pad verlichting kan zijn. Excitatiefilters beperken het spectrum van TL-verlichting en wanneer deze is gekoppeld met multi-pass dichroïsch spiegels en fluorescentie-emissie filters specifieke fluorescerende verbindingen visualiseren. De excitatie en emissie filters zijn gemonteerd in onafhankelijke, snel schakelen filter wielen te snel opeenvolgende acquisitie van verschillende fluorescentie kanalen mogelijk. De snelheid van de beeldopname wordt verder versterkt met een gevoelige en snelle EM-CCD-camera, handig voor de detectie van lage intensiteit signalen en korte imago gelezen keer. Milieu-controle op de Microscope wordt bereikt met een fase top verhit incubator en een objectieflens kachel monsters handhaven bij verhoogde temperaturen terwijl een bevochtigde en CO2 verrijkte atmosfeer wordt doorgegeven aan de incubator. De microscoop wordt bewaard in een verduisterde ruimte met omgevingstemperatuur onderhouden dicht bij 25 ° C en buiten licht geminimaliseerd met verduisterende gordijnen voor alle ramen. De volgende protocollen beschrijven het gebruik van dit systeem voor anterograde transport en verspreiding assays.
Een aantal alternatieven te controleren voor de variabelen van live cell imaging. De besturing van microscopie instellingen handmatig of via automatische systemen afhankelijk eigen software uitgevoerd. Fluorescentie verlichting kan worden bereikt met halogeen, LED of laser bronnen. De snelheid van beeldvorming wordt gewijzigd door de snelheid van de filter schakeling en de tijd om het signaal met de gepaarde detectiesysteem visualiseren. Milieu-controle kan met gespecialiseerde hardware worden gerealiseerd op de microscope fase behuizing van alle of een deel van de microscoop in een verwarmde en bevochtigde box, of door verhogen van de temperatuur van de ruimte waar microscopie wordt uitgevoerd. Elk van deze alternatieven heeft voor-en nadelen van kosten en prestatie.
In de daaropvolgende protocol, we detail het gebruik van beeldvorming van levende cellen snel anterograde vervoer en anterograde verspreiding van virussen alphaherpes studie door het gebruik van recombinante virale stammen. Real-time live cell imaging visualiseert capside, tegument, en / of glycoproteïne co-lokalisatie op dynamische structuren ondergaan vervoer binnen axonen 11. Overnachting timelapse beeldvorming van verzuilde neuronale culturen visualiseert axonale virion uitstappen en infectie van gevoelige cellen 12. De protocollen die hier gepresenteerd zijn geoptimaliseerd voor gebruik met onze specifieke imaging systeem, maar worden gepresenteerd in brede zin ten opzichte van de vier elementen van live cell imaging. In de discussie die wezal nader enkele optimalisatie die nodig zijn voor een succesvolle experimenten is.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van live cell imaging is het observeren van biologische processen zoals ze zich voordoen zonder significante verandering door de handeling van observatie. Dit doel wordt bereikt door het optimaliseren van drie variabelen: milieubeheer, snelheid van weergave en fluorescentieverlichting. Deze inter-afhankelijke variabelen moeten worden afgewogen om levensvatbare beeldvorming voorwaarden te bereiken. De protocollen gepresenteerd gebruik van specifieke voorwaarden aan de representatieve resultaten te produceren. We…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LWE en RK worden ondersteund door de US National Institutes of Health beurzen R37 NS033506-16 en R01 NS060699-03. MPT werd ondersteund door een American Cancer Society Postdoctoraal Research Fellowship (PF-10-057-01-MPC). Het advies en de kennis van dr. Matthew Lyman en Dr Oren Kobiler waren instrumentaal in het ontwerpen van de microscoop configuratie en live cell imaging methoden. Ook dank aan Neal Barlow en Brian T. Kain van Nikon Instruments voor hun technische bijstand bij de aanschaf, installatie en performance van de microscoop.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| 35 mm glass bottom culture dish | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 |
| Microscope body | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti |
| Motorized microscope X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top |
| Motorized filter wheels | Prior Scientific | HF110 10 position filter wheel |
| Fluorescent illumination source | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q |
| Multi-band Fluorescence filter sets | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad – ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry – ET |
| EM-CCD camera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 |
| Chamlide stage top environmental incubator | Live Cell Instruments; Seoul, South Korea | TC-L-10 |
| Objective lens heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Heater |
| Analysis software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
References
- Johnson, D. C., Baines, J. D. Herpesviruses remodel host membranes for virus egress. Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).
- Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. Herpesvirus assembly: a tale of two membranes. Current Opinion in Microbiology. 9 (4), 423-429 (2006).
- Saksena, M. M., Wakisaka, H., et al. Herpes simplex virus type 1 accumulation, envelopment, and exit in growth cones and varicosities in mid-distal regions of axons. Journal of Virology. 80 (7), 3592-3606 (2006).
- Snyder, A., Wisner, T. W., Johnson, D. C. Herpes Simplex Virus Capsids Are Transported in Neuronal Axons without an Envelope Containing the Viral Glycoproteins. Journal of Virology. 80 (22), 11165-11177 (2006).
- Snyder, A., Polcicova, K., Johnson, D. C. Herpes simplex virus gE/gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons. Journal of Virology. 82 (21), 10613-10624 (2008).
- Tomishima, M. J. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. The Journal of Cell Biology. 154 (4), 741-752 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Kratchmarov, R., Taylor, M. P., Enquist, L. W. Making the case: Married versus Separate models of alphaherpes virus anterograde transport in axons. Reviews in Medical Virology. 22 (6), 378-391 (2012).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Two modes of herpesvirus trafficking in neurons: membrane acquisition directs motion. Journal of Virology. 80 (22), 11235-11240 (2006).
- Del Rio, T., Ch’ng, T. H., Flood, E. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Heterogeneity of a fluorescent tegument component in single pseudorabies virus virions and enveloped axonal assemblies. Journal of Virology. 79 (7), 3903-3919 (2005).
- Taylor, M. P., Kramer, T., Lyman, M. G., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. Visualization of an alphaherpesvirus membrane protein that is essential for anterograde axonal spread of infection in neurons. mBio. 3 (2), (2012).
- Taylor, M. P., Kobiler, O. Alphaherpesvirus axon-to-cell spread involves limited virion transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).
- Kobiler, O., Brodersen, P., Taylor, M. P., Ludmir, E. B., Enquist, L. W. Herpesvirus replication compartments originate with single incoming viral genomes. mBio. 2 (6), (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Ch’ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 292-299 (2005).
- Curanovic, D., Ch’ng, T. H., Szpara, M., Enquist, L. Compartmented neuron cultures for directional infection by alpha herpesviruses. Current protocols in cell biology. Chapter 26 (Unit 26.4), (2009).
- Zareen, N., Greene, L. A. Protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG). J. Vis. Exp. (23), e988 (2009).
- Ch’ng, T. H., Enquist, L. W. Neuron-to-Cell Spread of Pseudorabies Virus in a Compartmented Neuronal Culture System. Journal of Virology. 79 (17), 10875-10889 (2005).
- Campenot, R. B., Lund, K., Mok, S. -. A. Production of compartmented cultures of rat sympathetic neurons. Nature Protocols. 4 (12), 1869-1887 (2009).
- Kramer, T., Greco, T. M., Taylor, M. P., Ambrosini, A. E., Cristea, I. M., Enquist, L. W. Kinesin-3 Mediates Axonal Sorting and Directional Transport of Alphaherpesvirus Particles in Neurons. Cell Host & Microbe. 12 (6), 806-814 (2012).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast-axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466 (2001).
- Kramer, T., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus Infection Disrupts Mitochondrial Transport in Neurons. Cell Host & Microbe. 11 (5), 504-514 (2012).
- Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Structure and Function. 27 (5), 335-341 (2002).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. Short-Term High-Resolution Imaging of Developing Hippocampal Neurons in Culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), (2012).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
