Живая изображений Сотовые Alphaherpes Вирус Антероградный транспорта и распространения
Summary
Изображений живых клеток инфекций alphaherpes вируса позволяет анализ динамики событий направленного транспорта и межклеточного распространения. Здесь мы представляем методики, которые используют рекомбинантные вирусные штаммы, экспрессирующие флуоресцентных белков слияния для облегчения визуализации сборки вирусной инфекции во время первичных нейронов.
Abstract
Прогресс в живой клетке флуоресценции микроскопии, а также конструирование рекомбинантных вирусных штаммов, экспрессирующих флуоресцентные белки слияния позволили визуализации в реальном времени транспортировки и распространение вирусной инфекции alphaherpes нейронов. Полезность новых флуоресцентных слитых белков вирусной мембраны, оболочки, и капсид, в сочетании с изображений живых клеток, которые были определены сборки вирусной частицы проходят транспорта в пределах аксонов. Похожие инструменты были успешно использованы для анализа межклеточных распространения вирусных частиц для количественной оценки количества и разнообразия вирионов передается между клетками. Важно отметить, что методы изображений живых клеток антероградной транспорта и распространением производят огромное количество информации, включая перенос частиц скоростей, распределение частиц, и временной анализ локализации белков. Наряду с классическими методами вирусного генетического, эти методологии обеспечили критические идеив важные механистической вопросы. В этой статье мы подробно описать методы визуализации, которые были разработаны, чтобы ответить на основные вопросы alphaherpes транспорта вирусов и распространения.
Introduction
Инфекция периферической нервной системы (ПНС) на alphaherpes вирусов, таких как вирус простого герпеса (ВПГ) -1, -2, и вирус псевдобешенства (PRV) включает в себя несколько сложных и строго регулируется шаги в течение жизненного цикла вируса. Транспортировка в нейроны ПНС имеет решающее значение во время событий первичной вирусной инфекции и последующего между хозяином распространения. Молекулярных механизмов, которые регулируют два компонента жизненного цикла вируса, направленного транспорта вирусной сборки от клеточных тел в аксоны (антероградной транспорта) и последующей передачи вирионов в чувствительные клетки (антероградной распространению) имеют важное значение для понимания патогенеза вируса герпеса.
Транспорта и выход вирусных частиц в нейронах зависит от сборки зрелых инфекционных 1,2 вириона. Ранее фиксированная анализов, в том числе иммунофлюоресценции (ИФ) и электронной микроскопии (ЭМ), были использованы для изучения состояния частиц сборки и протЭйн-взаимодействий, связанных с транспортом и распространении вириона 3-6. Однако динамичный характер транспортировки вирионов и экспериментальные артефакты введен химической фиксации посрамлены интерпретации неподвижных изображений в 7,8. В последнее время количество вирусных-флуоресцентных слитых белков были описаны для HSV и PRV, которые имеют незначительное воздействие на функцию белка. Зеленого флуоресцентного белка (GFP) и красного флуоресцентного белка (mCherry или MRFP) флуорофоров часто в паре, чтобы позволить отображение двух из трех структурных компонентов зрелых вирионов: капсид, оболочки и гликопротеин 9-11. Живых изображений сотовый антероградной транспорта с использованием двойного меченых вирусов визуализирует состояние сборки вирусных частиц во время транспортировки. Похожие флуорофором выразив вирусные штаммы используются для визуализации число и разнообразие вирусных геномов после распространения 12,13. Свойств флуоресцентных белков (см. обзор в 14,15) в значительной степени влияютвозможность визуализации вирусными или клеточными сборок. Внутренние свойства флуоресцентного белка, в том числе самостоятельно взаимодействий и стабильности, следует учитывать при разработке и тестировании нового белка слияния для сохранения дикого типа функциональности.
В сочетании с флуоресцентным белком слияния, два хорошо известных в системах пробирке культуру клеток используют для изображений живых клеток герпетической инфекции: диссоциированными 16 и разобщенным 17 (рис. 1А) крысы верхний шейный ганглий (SCG) нейронов. В обеих системах, эмбриональные SCG являются рассеченные, диссоциирован на одну клетку тела, и высевают для культивирования в пробирке 18. SCG нейронов являются частью вегетативной нервной системы и могут быть легко культивировать и дифференцированы по нейронной фактора роста (NGF) в зрелую поляризованного естественных условиях бывшего государства. Диссоциированных нейронов SCG образуют разветвленную сеть аксонов, который позволяет Fили визуализации вирусные частицы, поскольку они подвергаются антероградной транспорта 6. Разобщенным SCG культур обеспечивают гидравлической изоляции нейронов клетки тела (S ящиком) и дистальных концах аксона (N ящиком) 19. Ряд подробных протоколов для построения и использования обособленных нейронов с использованием оригинальных 20 или модифицированный Campenot камер 17 были опубликованы ранее. Гидравлической изоляции обеспечивает селективное инфекции тела нейронов и обнаружение вирионы потомства после транспортировки к изолированным концах аксона. Покрытие эпителиальных клеток над Термини до инфицирования обеспечивает клетки-реципиента для распространения вирусной инфекции.
Есть много важных элементов, важных для всех живых изображений экспериментов клетки, но наиболее актуальными для нашей протоколы: автоматизированный сбор изображений, флуоресцентное освещение, скорость визуализации и экологического контроля. Для всех изображений экспериментов, мы используемперевернутый, автоматизированные, эпифлуоресцентной микроскопом освещения (рис. 1В). Микроскоп построена вокруг Nikon Затмение Ti базы и использует ряд контролируемых компьютером моторизованных систем быстро перенастроить микроскопом во время автоматизированного захвата изображений. Для флуоресцентной подсветкой, мы используем широкий спектр ртутных ламп, которые могут быть ослаблены с фильтры нейтральной плотности вдоль освещения пути. Возбуждение фильтры ограничивают спектр флуоресцентного освещения и когда в паре с многоходовой дихроичных зеркал и флуоресцентных фильтров выбросов визуализировать конкретные флуоресцентные соединения. Возбуждения и излучения фильтры установлены в независимое, быстрое переключение фильтра колеса для быстрого последовательного приобретения различных флуоресцентных каналов. Скорость получения изображения еще более усиливается с чувствительной и быстрой EM-CCD камеры, полезны для обнаружения сигналов низкой интенсивности и малой изображение время чтения. Экологический контроль на MicroscОПЕ достигается со сценой верхней нагревается инкубатора и объективной линзы нагреватель для поддержания образцов при повышенных температурах при влажной и CO 2 атмосфере, обогащенной передается в инкубаторе. Микроскоп хранится в затемненной комнате с температурой окружающей среды поддерживается около 25 ° C и внешнего освещения минимизированы плотные шторы на всех окнах. Следующие протоколы описывают использование этой системы для антероградной транспорта и распространение анализов.
Число альтернатив существуют для контроля за переменными изображений живых клеток. Контролем микроскопа настройки может быть выполнена вручную или с помощью автоматических систем зависит от собственного программного обеспечения. Флуоресценция освещения может быть достигнута галогеном, светодиод или лазерных источников. Скорость визуализации модифицируют скорость переключения фильтра и время вывода сигнала с парными системы обнаружения. Экологический контроль может быть достигнут с специализированное оборудование на Мимикроскопе этапе, закрытый со всех или части микроскопа в подогретый и увлажненный ящика, или путем повышения температуры в помещении, где микроскопии будет выполнена. Каждый из этих вариантов имеет свои преимущества и недостатки, связанные с затратами и производительностью.
В последующем протоколе, мы подробно использование изображений живых клеток для изучения быстрого антероградной транспорта и антероградной alphaherpes распространение вирусов с использованием рекомбинантных вирусных штаммов. В режиме реального времени изображений живых клеток визуализирует капсида, оболочки, и / или гликопротеина совместной локализации на динамических структурах проходят аксоны транспорта в пределах 11. Ночевка интервальная съемка изображений из обособленных нейронов культур визуализирует аксональное выхода вирионов и заражение восприимчивых клетках 12. Протоколы, представленные здесь, были оптимизированы для использования с нашей конкретной системы визуализации, но представлены в широком смысле по отношению к четырем элементам изображений живых клеток. В ходе обсуждения мыбудет более подробно некоторые оптимизации, которые необходимы для успешного экспериментирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Цель изображений живых клеток наблюдает биологические процессы, как они происходят без существенного изменения актом наблюдения. Эта цель достигается за счет оптимизации трех переменных: экологический контроль, скорость обработки изображений, и флуоресцентной подсветкой. Эти взаим?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LWE РК и поддерживаются американским Национальным институтом здоровья гранты NS033506 R37-16 и R01 NS060699-03. MPT при поддержке Американского онкологического общества последующей исследовательской стипендии (PF-10-057-01-MPC). Советы и знания д-р Мэтью Лиман и доктор Орен Kobiler сыграли важную роль в проектировании конфигурации микроскопа и методов визуализации живой клетке. Мы также выражаем благодарность Нилу Барлоу и Брайан Т. Каин из Nikon Instruments за техническую помощь в приобретении, установке и производительности микроскопа.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| 35 mm glass bottom culture dish | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 |
| Microscope body | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti |
| Motorized microscope X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top |
| Motorized filter wheels | Prior Scientific | HF110 10 position filter wheel |
| Fluorescent illumination source | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q |
| Multi-band Fluorescence filter sets | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad – ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry – ET |
| EM-CCD camera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 |
| Chamlide stage top environmental incubator | Live Cell Instruments; Seoul, South Korea | TC-L-10 |
| Objective lens heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Heater |
| Analysis software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
References
- Johnson, D. C., Baines, J. D. Herpesviruses remodel host membranes for virus egress. Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).
- Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. Herpesvirus assembly: a tale of two membranes. Current Opinion in Microbiology. 9 (4), 423-429 (2006).
- Saksena, M. M., Wakisaka, H., et al. Herpes simplex virus type 1 accumulation, envelopment, and exit in growth cones and varicosities in mid-distal regions of axons. Journal of Virology. 80 (7), 3592-3606 (2006).
- Snyder, A., Wisner, T. W., Johnson, D. C. Herpes Simplex Virus Capsids Are Transported in Neuronal Axons without an Envelope Containing the Viral Glycoproteins. Journal of Virology. 80 (22), 11165-11177 (2006).
- Snyder, A., Polcicova, K., Johnson, D. C. Herpes simplex virus gE/gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons. Journal of Virology. 82 (21), 10613-10624 (2008).
- Tomishima, M. J. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. The Journal of Cell Biology. 154 (4), 741-752 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Kratchmarov, R., Taylor, M. P., Enquist, L. W. Making the case: Married versus Separate models of alphaherpes virus anterograde transport in axons. Reviews in Medical Virology. 22 (6), 378-391 (2012).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Two modes of herpesvirus trafficking in neurons: membrane acquisition directs motion. Journal of Virology. 80 (22), 11235-11240 (2006).
- Del Rio, T., Ch’ng, T. H., Flood, E. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Heterogeneity of a fluorescent tegument component in single pseudorabies virus virions and enveloped axonal assemblies. Journal of Virology. 79 (7), 3903-3919 (2005).
- Taylor, M. P., Kramer, T., Lyman, M. G., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. Visualization of an alphaherpesvirus membrane protein that is essential for anterograde axonal spread of infection in neurons. mBio. 3 (2), (2012).
- Taylor, M. P., Kobiler, O. Alphaherpesvirus axon-to-cell spread involves limited virion transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).
- Kobiler, O., Brodersen, P., Taylor, M. P., Ludmir, E. B., Enquist, L. W. Herpesvirus replication compartments originate with single incoming viral genomes. mBio. 2 (6), (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Ch’ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 292-299 (2005).
- Curanovic, D., Ch’ng, T. H., Szpara, M., Enquist, L. Compartmented neuron cultures for directional infection by alpha herpesviruses. Current protocols in cell biology. Chapter 26 (Unit 26.4), (2009).
- Zareen, N., Greene, L. A. Protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG). J. Vis. Exp. (23), e988 (2009).
- Ch’ng, T. H., Enquist, L. W. Neuron-to-Cell Spread of Pseudorabies Virus in a Compartmented Neuronal Culture System. Journal of Virology. 79 (17), 10875-10889 (2005).
- Campenot, R. B., Lund, K., Mok, S. -. A. Production of compartmented cultures of rat sympathetic neurons. Nature Protocols. 4 (12), 1869-1887 (2009).
- Kramer, T., Greco, T. M., Taylor, M. P., Ambrosini, A. E., Cristea, I. M., Enquist, L. W. Kinesin-3 Mediates Axonal Sorting and Directional Transport of Alphaherpesvirus Particles in Neurons. Cell Host & Microbe. 12 (6), 806-814 (2012).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast-axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466 (2001).
- Kramer, T., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus Infection Disrupts Mitochondrial Transport in Neurons. Cell Host & Microbe. 11 (5), 504-514 (2012).
- Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Structure and Function. 27 (5), 335-341 (2002).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. Short-Term High-Resolution Imaging of Developing Hippocampal Neurons in Culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), (2012).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
