Imagerie de cellules vivantes de Alphaherpes Virus Transport antérograde et la propagation

Summary

Imagerie des cellules vivantes d'infections virales alphaherpes permet d'analyser les événements dynamiques de transport dirigée et la propagation intercellulaire. Ici, nous présentons des méthodes qui utilisent des souches virales recombinantes exprimant des protéines de fusion fluorescentes pour faciliter la visualisation des assemblages virale lors d'une infection de neurones primaires.

Abstract

Les progrès des techniques vivantes des cellules par microscopie de fluorescence, ainsi que la construction de souches virales recombinantes exprimant des protéines de fusion fluorescentes ont permis la visualisation en temps réel du transport et de la propagation de l'infection par le virus alphaherpes des neurones. L'utilité de nouvelles protéines de fusion fluorescentes à membrane virale, tégument, et capsides, en conjonction avec l'imagerie des cellules vivantes, identifié ensembles de particules virales subissant transport à l'intérieur des axones. Des outils similaires ont été utilisées avec succès pour les analyses de cellule à cellule propagation de particules virales de quantifier le nombre et la diversité des virions transmis entre les cellules. Surtout, les techniques d'imagerie des cellules vivantes du transport antérograde et la propagation de produire une foule de renseignements, y compris des vitesses de particules de transport, de distribution de particules, et des analyses temporelles de la localisation des protéines. A côté des techniques génétiques virales classiques, ces méthodes ont fourni des renseignements cruciauxen questions mécanistiques importantes. Dans cet article, nous décrivons en détail les méthodes d'imagerie qui ont été développés pour répondre aux questions de base du transport de virus alphaherpes et la propagation.

Introduction

Infection du système nerveux périphérique (SNP) par alphaherpes virus tels que le virus de l'herpès simplex (HSV) -1, -2 et virus de la pseudo-rage (PRV) comporte plusieurs étapes complexes et fortement réglementés au long du cycle de vie du virus. Transport dans les neurones du SNP est essentiel pendant les événements des deux infection virale primaire et la suite propagation inter-hôte. Les mécanismes moléculaires qui modulent deux composantes du cycle de vie du virus, le transport dirigé des assemblées virales loin des corps cellulaires dans les axones (transport antérograde) et de la transmission ultérieure des virions aux cellules sensibles (propagation antérograde) sont importantes pour comprendre la pathogenèse herpèsvirus.

Le transport et l'évacuation des particules virales dans les neurones dépend de l'assemblage d'un ^1,2 virion infectieux mature. Dosages préalablement fixés, y compris immunofluorescence (IF) et la microscopie électronique (EM), ont été utilisés pour étudier l'état de l'ensemble des particules et protinteractions ein associés au transport du virion et la propagation ^3-6. Toutefois, la nature dynamique des virions transport et des artefacts expérimentaux mis en place par fixation chimique confondu l'interprétation des images fixes ^7,8. Récemment, un certain nombre de protéines de fusion virale fluorescentes ont été décrits pour le HSV et PRV qui ont des répercussions négligeables sur la fonction des protéines. Green Fluorescent Protein (GFP) et des protéines fluorescentes rouges (mCherry ou mRFP) fluorophores sont souvent jumelés pour permettre l'imagerie de deux des trois composantes structurelles d'un virion maturité: capside, tégument, et la glycoprotéine ^9-11. Vivez l'imagerie cellulaire du transport antérograde utilisant des virus à double marquage visualise l'état d'assemblage des particules virales durant le transport. Fluorophore similaire exprimant souches virales sont utilisés pour visualiser le nombre et la diversité des génomes viraux suivants propagation ^12,13. Les propriétés des protéines fluorescentes (revue de ^14,15) influent considérablement surla capacité de visualiser assemblées virales ou cellulaires. Les propriétés intrinsèques de la protéine fluorescente, y compris l'auto-interactions et la stabilité, devraient être considérés lors de la conception et de tester de nouvelles protéines de fusion pour la préservation de la fonctionnalité de type sauvage.

En conjonction avec des protéines de fusion fluorescentes, deux bien caractérisés dans les systèmes de culture cellulaire in vitro sont utilisés pour l'imagerie des cellules vivantes de l'infection par le virus de l'herpès: dissocié ¹⁶ et compartimenté ¹⁷ (figure 1A) ganglions neurones cervicaux supérieurs de rat (CTB). Dans les deux systèmes, embryonnaire SCG de sont disséqués, dissocié à des organismes unicellulaires, et plaqué par culture in vitro ^18. SCG neurones font partie du système nerveux autonome et peut être facilement cultivées et différenciées par le facteur de croissance neuronal (NGF) dans un état ​​polarisé matures ex vivo. Neurones SCG dissociées forment un réseau étendu d'axones qui permet fou la visualisation de particules virales car ils subissent le transport antérograde ^6. SCG cultures compartimentées offrent une isolation fluidique du corps cellulaire des neurones (S compartiment) et terminaisons axonales distales (compartiment N) ^19. Un certain nombre de protocoles détaillés pour la construction et l'utilisation des neurones compartimentées aide initiale ^{de 20} ou modifié Campenot chambres ¹⁷ ont été publiés précédemment. Isolement fluidique permet d'infection sélective des corps cellulaires neuronaux et la détection des virions fils après le transport de la gare Termini de l'axone isolés. Placage cellules épithéliales sur les terminaisons avant l'infection fournit des cellules réceptrices de la propagation de l'infection virale.

Il ya beaucoup d'éléments essentiels importants pour tous vivent expérimentation d'imagerie cellulaire, mais le plus pertinent pour nos protocoles sont les suivants: acquisition automatique de l'image, éclairage fluorescent, la vitesse de l'imagerie et le contrôle de l'environnement. Pour toutes les expériences d'imagerie, nous utilisonsinversé, automatisé, microscope d'éclairage à épifluorescence (figure 1B). Le microscope est construit autour du Nikon Eclipse base de Ti et emploie un certain nombre de systèmes motorisés commandés par ordinateur pour reconfigurer rapidement le microscope lors de l'acquisition automatique d'images. Pour l'éclairage par fluorescence, nous utilisons un large spectre mercure lampe à arc qui peut être atténué avec des filtres de densité neutre le long de la voie d'éclairage. filtres d'excitation limiter le spectre de l'éclairage fluorescent et lorsqu'il est associé à des miroirs dichroïques multi-pass et filtres d'émission de fluorescence visualiser composés fluorescents spécifiques. Les filtres d'excitation et d'émission sont montés à commutation rapide roues indépendantes, le filtre pour permettre l'acquisition séquentielle rapide des différents canaux fluorescents. La vitesse d'acquisition des images est encore améliorée avec une caméra EM-CCD sensible et rapide, utile pour la détection des signaux de faible intensité et de courte images fois lu. Contrôle de l'environnement sur la microscOPE est réalisée avec un haut stade chauffé incubateur et un chauffage de l'objectif de maintenir les échantillons à des températures élevées pendant une atmosphère humidifiée ₂ et CO enrichi est passé dans l'incubateur. Le microscope est gardé dans une pièce sombre avec une température ambiante maintenue à près de 25 ° C et la lumière extérieure réduite avec des rideaux occultants sur toutes les fenêtres. Les protocoles suivants décrivent l'utilisation de ce système pour le transport antérograde et des essais d'étalement.

Un certain nombre d'alternatives existent pour contrôler les variables d'imagerie des cellules vivantes. Le contrôle des paramètres de microscopie peut être effectuée manuellement ou par des systèmes automatisés qui dépendent de logiciels propriétaires. Éclairage par fluorescence peut être réalisé avec des sources laser halogène, LED ou. La vitesse de formation d'image est modifiée par la vitesse de commutation du filtre et le temps pour visualiser le signal dans le système de détection couplé. Contrôle de l'environnement peut être réalisé avec du matériel spécialisé sur la miétape de croscope, enceinte de tout ou partie du microscope dans une boîte chauffé et humidifié, ou en élevant la température de la pièce où microscopie sera effectuée. Chacune de ces alternatives a ses avantages et inconvénients liés aux coûts et à la performance.

Dans le protocole suivant, nous détaillons l'utilisation de l'imagerie des cellules vivantes pour étudier le transport antérograde rapide et la propagation antérograde de alphaherpes virus grâce à l'utilisation de souches virales recombinantes. Imagerie des cellules vivantes en temps réel visualise capside, tégument et / ou glycoprotéine co-localisation des structures dynamiques qui subissent le transport dans les axones ^11. Imagerie timelapse nuit de cultures de neurones compartimentées visualise sortie du virion axonale et l'infection de cellules sensibles ^12. Les protocoles présentés ici ont été optimisés pour une utilisation avec notre système d'imagerie en particulier, mais sont présentés en termes généraux par rapport aux quatre éléments d'imagerie des cellules vivantes. Dans la discussion que nousseront plus en détail certains de l'optimisation qui est nécessaire pour l'expérimentation réussie.

Protocol

Section 1 – Conditions de contrôle de l'environnement pour la microscopie par fluorescence des cellules vivantes 30 min avant toute expérience d'imagerie connecter et commencer à chauffer le microscope étage supérieur incubateur. Allumez le microscope, les sources de lumière transmise et épifluorescent, et les commandes de matériels automatisés. Ouvrez le logiciel de contrôle de microscope, NIS Elements, pour se connecter au microscope et commencer à refroidir l'appareil EM-CCD…

Representative Results

Transport antérograde L'application de ce protocole d'infections des cultures SCG dissociées avec PRV 348, une souche PRV recombinant exprimant la GFP-US9 et des protéines de fusion membranaire gM mCherry, a facilité la visualisation du transport antérograde des virions (Figure 3 et Movie supplémentaires 4). L'incorporation de ces protéines de fusion dans des particules virales résultats dans leur détection sur le transport lacrymaux, et le…

Discussion

Le but de l'imagerie des cellules vivantes est l'observation des processus biologiques tels qu'ils se présentent sans altération significative par l'acte d'observation. Cet objectif est atteint par l'optimisation de trois variables: le contrôle de l'environnement, de la vitesse de l'imagerie et l'éclairage par fluorescence. Ces variables interdépendantes doivent être équilibrées pour obtenir des conditions d'imagerie viables. Les protocoles présentés utilisent des condit…

Materials

Name	Company	Catalogue number
35 mm glass bottom culture dish	MatTek Corporation; Ashland, MA	P35G-1.5-20-C
35 mm μ-Dish	Ibidi USA LLC, Verona, WI	81156
Microscope body	Nikon Instruments Inc.	Nikon Eclipse Ti
Motorized microscope X-Y stage	Prior Scientific; Rockland, MA	H117 ProScan Flat Top
Motorized filter wheels	Prior Scientific	HF110 10 position filter wheel
Fluorescent illumination source	Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada	X-Cite 120Q
Multi-band Fluorescence filter sets	Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT	89000 Sedat Quad – ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry – ET
EM-CCD camera	Andor Technology USA; South Windsor, CT	iXon3 897
Chamlide stage top environmental incubator	Live Cell Instruments; Seoul, South Korea	TC-L-10
Objective lens heater	Bioptecs; Butler, PA	150803 Controller 150819-12-08 Heater
Analysis software	Nikon Instruments Inc.; Melville, NY	NIS Elements