Live Cell Imaging von Alphaherpes Virus Anterograde Transport und Aufstrich
Summary
Live-Cell-Imaging von alphaherpes Virusinfektionen ermöglicht die Analyse der dynamischen Ereignisse gerichteten Transport und interzelluläre Ausbreitung. Hier präsentieren wir Methoden, die rekombinanten viralen Stämmen, fluoreszierende Fusionsproteine Visualisierung der viralen Baugruppen während der Infektion von primären Neuronen erleichtern nutzen.
Abstract
Advances in lebenden Zellen Fluoreszenzmikroskopie Techniken, sowie die Konstruktion von rekombinanten Virusstämme, die fluoreszierende Fusionsproteine exprimieren haben Echtzeit-Visualisierung von Transport und die Ausbreitung von alphaherpes Virusinfektion von Neuronen aktiviert. Der Nutzen der neuen fluoreszierenden Fusionsproteine Virusmembran, Spelzen und Kapside in Verbindung mit Live Cell Imaging, identifiziert Viruspartikel Baugruppen unterziehen Transport innerhalb Axone. Ähnliche Instrumente wurden erfolgreich für die Analyse von Zell-Zell von Viruspartikeln verbreitet, um die Anzahl und die Vielfalt der Virionen zwischen Zellen übertragen quantifizieren beschäftigt. Wichtig ist, produzieren die Techniken des Live Cell Imaging der anterograde Transport und Ausbreitung eine Fülle von Informationen, einschließlich Partikeltransport Geschwindigkeiten, Verteilungen von Partikeln und zeitliche Analysen von Protein-Lokalisierung. Neben den klassischen viralen genetischen Techniken haben diese Methoden kritische Einblicke bereitgestelltin wichtige mechanistische Fragen. In diesem Artikel beschreiben wir im Detail die bildgebenden Verfahren, die entwickelt, um grundlegende Fragen der alphaherpes Virus Transport und Ausbreitung zu beantworten waren.
Introduction
Infektion des peripheren Nervensystems (PNS) durch alphaherpes Viren wie Herpes-simplex-Virus (HSV) -1, -2 und Pseudorabies-Virus (PRV) umfasst mehrere komplizierte und stark regulierten Schritte gesamten Lebenszyklus des Virus. Transport innerhalb der Neuronen des PNS ist kritisch während der Ereignisse der beiden primären Virusinfektion und anschließende inter-Host Verbreitung. Die molekularen Mechanismen, die beiden Komponenten des viralen Lebenszyklus modulieren; gerichteten Transport von viralen Baugruppen vom Zellkörper in Axonen (anterograde Transport) und die anschließende Übertragung der Virionen auf empfängliche Zellen (anterograde Spread) sind wichtig, um Verständnis Herpesvirus Pathogenese.
Die Transport-und Austritt von Viruspartikeln in Neuronen ist abhängig von der Montage eines reifen infektiösen Virion 1,2. Vorher festgelegten Assays, einschließlich Immunfluoreszenz (IF) und Elektronenmikroskopie (EM), wurden verwendet, um die Teilchen Montagezustand und prot studierenEin Wechselwirkungen mit virion Transport und Ausbreitung 3-6 verbunden. Doch die dynamische Natur der Transport Virionen und experimentelle Artefakte durch chemische Fixierung führte die Interpretation der fixierten Bilder 7,8 verwechselt. In jüngster Zeit haben eine Reihe von viralen fluoreszierenden Fusionsproteine für HSV und PRV, die geringe Auswirkungen auf die Protein-Funktion beschrieben worden. Green Fluorescent Protein (GFP) und Rot fluoreszierende Proteine (mCherry oder mRFP) Fluorophore sind oft gepaart Bildgebung von zwei der drei strukturellen Komponenten eines reifen Virion erlauben: Kapsid, Spelzen, und Glykoprotein 9-11. Live Cell Imaging der anterograde Transport mit Dual-markierten Viren visualisiert die Montage Zustand der viralen Partikel während des Transports. Ähnliche Fluorophor Ausdruck Virusstämme werden verwendet, um Anzahl und die Vielfalt der viralen Genomen nach Ausbreitung 12,13 visualisieren. Die Eigenschaften der fluoreszierenden Proteine (Bewertung in 14,15) stark beeinflussendie Fähigkeit, virale oder zelluläre Baugruppen visualisieren. Die intrinsischen Eigenschaften des fluoreszierenden Proteins, einschließlich Self-Interaktionen und Stabilität, sollten bei der Entwicklung und Erprobung neuer Protein-Fusionen für die Erhaltung der Wildtyp-Funktionalität werden.
In Verbindung mit fluoreszierenden Protein-Fusionen, zwei in vitro-Zellkultur-Systeme gut charakterisiert sind für Live-Cell-Imaging von Herpes-Virus-Infektion eingesetzt: dissoziierten 16 und 17 Kompartimente (Abbildung 1A) Ratte überlegen Halsganglien (SCG) Neuronen. Bei beiden Systemen werden embryonale SCG seziert, dissoziiert einzigen Zellkörper und plattiertem zur in vitro Kultivierung von 18. SCG Neuronen sind Teil des vegetativen Nervensystems und kann leicht kultiviert und differenziert von neuronalen Wachstumsfaktor (NGF) zu einer reifen polarisierten Zustand ex vivo. Dissoziierte SCG Neuronen bilden ein ausgedehntes Netz von Axonen, die f erlaubtoder die Visualisierung von viralen Partikeln, wie sie anterograden transport 6 zu unterziehen. Unterteilte SCG Kulturen bieten fluidischen Trennung der neuronalen Zellkörper (S Abteil) und distalen Axon-Termini (N Abteil) 19. Eine Reihe von detaillierten Protokolle für den Bau und die Nutzung von compartmentalized Neuronen mit original 20 oder mutierend Campenot Kammern 17 wurden bereits veröffentlicht. Fluidic Isolierung ermöglicht selektive Infektion von neuronalen Zellkörper und den Nachweis von Nachkommenvirionen nach dem Transport zu isolierten Axon-Termini. Plating Epithelzellen über den Termini vor der Infektion bietet Rezipientenzellen für Ausbreitung der Virusinfektion.
Es gibt viele wesentliche Elemente wichtig für alle Live Cell Imaging Experimente, aber die meisten für uns relevanten Protokolle sind: automatisierte Bildaufnahme, fluoreszierende Beleuchtung, die Geschwindigkeit der Bildgebung und Umweltkontrolle. Für alle bildgebenden Experimenten verwenden wireine invertierte, automatisierte Epifluoreszenz Beleuchtung Mikroskop (Abbildung 1B). Das Mikroskop ist rund um die Nikon Eclipse-Ti Basis gebaut und beschäftigt eine Reihe von Computer gesteuert motorisierten Systeme möglichst schnell rekonfiguriert das Mikroskop während automatisierte Bildaufnahme. Für Fluoreszenz-Beleuchtung, verwenden wir ein breites Spektrum Quecksilberbogenlampe, die gedämpft werden mit Neutralfilter entlang der Beleuchtungspfad können. Anregung Filter begrenzen das Spektrum der Fluoreszenz-Beleuchtung und wenn es mit Multi-Pass-dichroitischen Spiegel und Fluoreszenzemission Filter visualisieren spezifischen fluoreszierenden Verbindungen gepaart. Die Anregungs-und Emissions-Filter werden in unabhängigen, schnelles Umschalten Filter Räder montiert, um eine schnelle sequentielle Erwerb von verschiedenen fluoreszierenden Kanäle ermöglichen. Die Geschwindigkeit der Bildaufnahme ist ferner mit einer empfindlichen und schnellen EM-CCD-Kamera, nützlich für die Detektion von niedriger Signalstärke und kurze Bild Lesezeiten verbessert. Umweltkontrolle auf der MicroscOPE ist mit einer Bühne oben Wärmeschrank und eine Objektivlinse Heizgerät Proben bei erhöhten Temperaturen zu halten, während ein befeuchtet und CO 2 angereicherten Atmosphäre in den Inkubator geleitet wird erreicht. Das Mikroskop wird in einem abgedunkelten Raum mit Umgebungstemperatur gehalten knapp 25 ° C gehalten und Außenleuchte mit Verdunkelung an allen Fenstern minimiert. Die folgenden Protokolle beschreiben die Verwendung dieses Systems für anterograde Transport und Ausbreitung Assays.
Eine Reihe von Alternativen gibt es für die Variablen des Live Cell Imaging steuern. Die Steuerung der Mikroskopie Einstellungen können manuell oder durch automatisierte Systeme abhängig von proprietärer Software durchgeführt werden. Fluoreszenz Beleuchtung kann mit Halogen-, LED-oder Laser-Quellen erreicht werden. Die Geschwindigkeit der Bildgebung durch die Geschwindigkeit der Filterwechsel und die Zeit, um das Signal mit dem gepaarten Detektionssystem sichtbar verändert. Umwelt-Steuerung kann mit spezialisierten Hardware auf dem Meilen erreicht werdenkroskop Stufe Gehäuse ganz oder teilweise von dem Mikroskop in einem erwärmten und befeuchteten Feld oder durch Erhöhen der Temperatur des Raumes, wo Mikroskopie durchgeführt wird. Jede dieser Alternativen hat Vor-und Nachteile in Bezug auf Kosten und Leistung.
In der anschließenden Protokoll, detail wir den Einsatz von Live Cell Imaging, um eine schnelle anterograde Transport und anterograde Ausbreitung von Viren alphaherpes durch den Einsatz von rekombinanten Virusstämme zu studieren. Echtzeit-Live Cell Imaging visualisiert Kapsid, Spelzen, und / oder Glykoprotein Co-Lokalisation auf dynamische Strukturen unterziehen Transport innerhalb 11 Axone. Übernachtung Zeitraffer Bildgebung compartmentalized neuronalen Kulturen visualisiert axonal virion Austritt und Infektion empfänglicher Zellen 12. Die hier vorgestellten Protokolle sind für den Einsatz mit unseren speziellen Imaging-System optimiert worden, sind aber in groben Zügen in Bezug auf die vier Elemente des Live Cell Imaging präsentiert. In der Diskussion, die wirwird näher einige der Optimierung, die notwendig für eine erfolgreiche Experimente ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Ziel des Live Cell Imaging beobachtet biologische Prozesse, wie sie ohne signifikante Veränderung durch den Akt der Beobachtung auftreten. Umwelt-Kontrolle, die Geschwindigkeit der Bildgebung und Fluoreszenz-Beleuchtung: Dieses Ziel wird durch die Optimierung der drei Variablen erreicht. Diese inter-abhängigen Variablen müssen ausgeglichen werden, um tragfähige Abbildungsbedingungen erreichen. Die Protokolle vorgestellt nutzen spezifischen Bedingungen, die repräsentative Ergebnisse zu produzieren. Wir werden ku…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LWE und RK werden von der US National Institutes of Health Zuschüsse R37 NS033506-16 und R01-03 NS060699 unterstützt. MPT wurde von einem American Cancer Society Postdoctoral Research Fellowship (PF-10-057-01-MPC) unterstützt. Die Beratung und das Wissen von Dr. Matthew Lyman und Dr. Oren Kobiler waren maßgeblich an der Gestaltung des Mikroskops Konfiguration und Live Cell Imaging Verfahren. Wir verlängern auch dank Neal Barlow und Brian T. Kain von Nikon Instruments für ihre technische Unterstützung bei der Anschaffung, Installation und Performance des Mikroskops.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| 35 mm glass bottom culture dish | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 |
| Microscope body | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti |
| Motorized microscope X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top |
| Motorized filter wheels | Prior Scientific | HF110 10 position filter wheel |
| Fluorescent illumination source | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q |
| Multi-band Fluorescence filter sets | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad – ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry – ET |
| EM-CCD camera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 |
| Chamlide stage top environmental incubator | Live Cell Instruments; Seoul, South Korea | TC-L-10 |
| Objective lens heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Heater |
| Analysis software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
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