Covalente binding van BMP-2 op oppervlakken met een Zelf-geassembleerde monolaag Aanpak
Summary
We beschrijven een werkwijze voor het bewerkstelligen van een efficiënte immobilisatie van BMP-2 op oppervlakken. Onze benadering is gebaseerd op de vorming van een zelf samengestelde monolaag op de covalente binding van BMP-2 via zijn vrije amine residuen bereiken. Deze methode is een nuttig hulpmiddel om signalering te studeren aan het celmembraan.
Abstract
Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is een groeifactor ingebed in de extracellulaire matrix van botweefsel. BMP-2 fungeert als trekker van mesenchymale celdifferentiatie in osteoblasten, waardoor het stimuleren van genezing en de novo botvorming. Het klinisch gebruik van recombinant humaan BMP-2 (rhBMP-2) samen met steigers is opgeheven recente controverses, gebaseerd op de wijze van presentatie en de hoeveelheid te leveren. De hier gepresenteerde protocol is een eenvoudige en efficiënte manier om BMP-2 te leveren in vitro studies op cellen. We beschrijven hoe je een zelf-geassembleerde monolaag bestaande uit een heterobifunctionele linker vormen, en tonen de daaropvolgende binding stap om covalente immobilisatie van rhBMP-2 te verkrijgen. Met deze benadering is het mogelijk om een aanhoudende presentatie van BMP-2 met behoud van de biologische activiteit van het eiwit. In feite, het oppervlak immobilisatie van BMP-2 kan gerichte onderzoek door voorkoming onspecifieke advertentiesorption, terwijl het verminderen van de hoeveelheid groeifactor en, met name, belemmeren ongecontroleerd vrijkomen van het oppervlak. Zowel korte en lange termijn signalering gebeurtenissen veroorzaakt door BMP-2 plaatsvinden wanneer cellen worden blootgesteld aan oppervlakken presenteren covalent geïmmobiliseerd rhBMP-2, waardoor deze benadering geschikt in vitro naar celreacties op BMP-2 stimulatie.
Introduction
Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is een lid van de transformerende groeifactor (TGF-β) familie en fungeert als inductor van de novo botvorming en regulator van verschillende weefsels tijdens de embryonale ontwikkeling en volwassen homeostase 1-3. Elke monomeer van de homodimeer biologisch actieve BMP-2-eiwit bevat een "cysteïne knoop" motief, die sterk geconserveerd in alle BMP 4. Zes van de zeven cysteïneresten vormen intramoleculaire disulfide bindingen die elk monomeer stabiliseren, terwijl de zevende cysteine betrokken bij dimerisatie, die een intermoleculaire binding tussen de twee monomeren 5,6. Deze zeer geconserveerde cysteïne knoop wordt de driedimensionale structuur van het eiwit BMP-2 en bepaalt de unieke eigenschappen, zoals resistentie tegen hitte, samenstelling en zure pH 7-9. BMP-2 bindt aan serine / threonine kinase transmembrane receptoren, waardoor signaaltransductie induceren <sup> 10-12. Afhankelijk van de wijze van receptor oligomerisatie worden verschillende signaalwegen geactiveerd: een Smad-onafhankelijke signalering cascade leidt tot alkalische fosfatase-inductie via p38 signalering, terwijl een Smad-afhankelijke route geactiveerd door fosforylatie van de receptor resulteert in Smad complexe nucleaire translocatie en activering van transcriptie van specifieke doelgenen, zoals de remmer van differentiatie (Id) 12-14.
In bone, BMP-2 induceert de differentiatie van mesenchymale stamcellen in osteoblasten stimuleren zo de genezing en de novo botvorming. Momenteel, recombinant tot expressie BMP-2 is klinisch toegepast om de genezing van gebroken websites te verbeteren. Een gemeenschappelijke strategie botweefsel is het gebruik van injecteerbare groeifactoren, die minder invasief dan de lokale systemen. In vivo studies en klinische toepassingen hebben aangetoond dat de korte biologische halfwaardetijd, niet-specifieke localization en snelle lokale klaring van BMP-2 kan leiden tot verschillende lokale, buitenbaarmoederlijke en systemische problemen 15. Tot een effectieve presentatie, het insluiten of immobilisatie van BMP-2 in of op grondstoffen te verkrijgen noodzakelijk voor de lokale en langdurige afgifte op de doelplaats. Langdurige afgifte kan worden bereikt met niet-covalente retentie benaderingen, zoals fysieke insluiting, adsorptie of ion complexering 16. Het is echter bekend dat niet-specifieke adsorptie van eiwitten aan oppervlakken leidt tot denaturatie van de moleculen 17. Voor de covalente binding van groeifactoren, hebben verschillende soorten dragers zijn ontwikkeld in het afgelopen decennium. Het gebruik van bifunctionele koppeling moleculen die amino-of carboxylgroepen van het eiwit gericht is bijvoorbeeld een type aanpak die niet noodzakelijkerwijs vereist eiwitmodificatie zijn immobilisatie bereiken. In feite, terwijl eiwitmodificatie biedt het voordeel van het controleren eiwit oriëntatie,de introductie van kunstmatige domeinen peptide tags en plaatsspecifieke ketens kunnen veranderen de biologische activiteit van groeifactoren 17. Aldus denaturatie omzeilen door de wisselwerking met het dragermateriaal, oppervlakken worden vooraf gefunctionaliseerd, bijvoorbeeld met een zelf-geassembleerde monolaag (SAM) van een verbindende molecule, gevolgd door koppeling van de gewenste factor 18. We hebben een SAM-gebaseerde benadering covalent immobiliseren BMP-2 op een oppervlak doelwit zijn vrije amine residuen en hebben aangetoond dat het geïmmobiliseerde eiwit behoudt zowel de korte en lange termijn biologische activiteit 19. Dit protocol is een eenvoudige en efficiënte manier om BMP-2 te leveren aan cellen in vitro naar de mechanismen die optreden met de celmembraan en reguleren intracellulaire signalering verantwoordelijk voor osteogene signalering.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol beschrijven we de bereiding van oppervlak gefunctionaliseerd met bioactieve rhBMP-2. Deze benadering omvat twee stappen: 1) de initiële vorming van een zelf-assemblerende monolaag (SAM) van een bifunctionele linker aan het gouden oppervlak, 2) covalente immobilisatie van het rhBMP-2-eiwit. In eerdere werk, we gevalideerde de effectieve binding van de bifunctionele linker en de groeifactor, en toonde aan dat het oppervlak geïmmobiliseerd rhBMP-2 behoudt zijn biologische activiteit 19. De bioa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken prof. dr. JP Spatz (Department of Biofysische Chemie, Universiteit van Heidelberg en het ministerie van nieuwe materialen en Biosystems, Max Planck Institute for Intelligent Systems, Stuttgart) voor zijn vriendelijke ondersteuning. De financiële steun van het Max-Planck-Gesellschaft en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 naar EAC-A.) Zijn ook sterk erkend.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 4-(dimethylamino)pyridin | Sigma-Aldrich | 522805 | |
| Acetone | AppliChem | A2282 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma-Aldrich | 674427 | |
| Dichlormethane | Merck | 106050 | |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | |
| Petroleum benzene | Merck | ||
| Glass coverslips | Carl Roth | M 875 | |
| Ethylacetate | AppliChem | A3550 | |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | |
| N,N-dimethylformamide | Carl Roth | T921 | |
| rhBMP-2 | R&D Systems | 355-BM | Carrier-free; expressed in E.coli |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Anti-rhBMP-2 | Sigma | B9553 | |
| Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Secondary antibody |
| Ampliflu Red assay | Sigma | 90101 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid | Gibco | 41966 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | Sterile filtered, cell culture tested |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na | Gibco | 25300 | |
| Glycine (0.1 M) | Riedel-de Haën | 33226 | |
| IGEPAL CA-630 (1%) | Sigma | I8896 | Lysis buffer (ALP assay)19 |
| Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) | Carl Roth | HNO3.2 | |
| Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) | Carl Roth | 3533.1 | |
| p-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | S0942 | Phosphatase substrate |
| Anti-mysin heavy chain (MHC) | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | MF20 | Monoclonal antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A11001 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Equipment | |||
| Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG | ||
| MED 020 Sputtercoating system | BAL-TEC AG | Coating conditions Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec |
|
| Tecan Infinite M200 Plate reader | Tecan |
References
- Helm, G., Andersson, D., et al. Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science. Spine. 27 (16S), S9 (2002).
- Hogan, B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).
- Reddi, A. BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).
- Rengachary, S. Bone morphogenetic proteins: basic concepts. Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).
- Schlunegger, M., Grütter, M. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2. Nature. 358, 430-434 (1992).
- Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution. J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).
- Nimni, M. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).
- Wozney, J., Rosen, V. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. Related Res. 346, 26 (1998).
- Rosen, V. BMP and BMP inhibitors in bone. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).
- Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).
- Keller, S., Nickel, J., et al. Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).
- Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).
- Nohe, A., Hassel, S., et al. The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways. J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).
- Sieber, C., Kopf, J., et al. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells. Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).
- Gonçalves, R., Martins, M., et al. Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).
- Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
- Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
- Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).
- Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. Growth factor release from tissue engineering scaffolds. J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).
- Uludag, H., D’Augusta, D., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces. Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).
- Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).
- Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. Delivery systems for bone growth factors – the new players in skeletal regeneration. J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).
- Masters, K. S. Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration. Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).
- Crouzier, T., Fourel, L., et al. Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration. Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).
- Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).
- Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
- Kato, K., Sato, H., Iwata, H. Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays. Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).
- Martins, M., Curtin, S., et al. Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide. J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).
- Limbut, W., Kanatharana, P., et al. A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid. Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).
- Patel, N., Davies, M., et al. Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers. Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).
- Hu, J., Duppatla, V., et al. Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues. Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).
- Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
- Cao, T., Wang, A., et al. Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM. Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).
- Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy. Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).
