Legame covalente di BMP-2 su superfici utilizzando un auto-assemblato Monolayer Approccio
Summary
Noi descriviamo un metodo per realizzare immobilizzazione efficiente di BMP-2 sulle superfici. Il nostro approccio si basa sulla formazione di un monostrato auto-assemblato per realizzare il legame di BMP-2 attraverso i suoi residui amminici liberi covalente. Questo metodo è un utile strumento per studiare la segnalazione alla membrana cellulare.
Abstract
Proteina morfogenetica 2 (BMP-2) è un fattore di crescita incorporato nella matrice extracellulare del tessuto osseo. BMP-2 funge da innesco della differenziazione delle cellule mesenchimali in osteoblasti, stimolando così la guarigione e la formazione ossea novo de. L'uso clinico di ricombinante umano BMP-2 (rhBMP-2) in combinazione con ponteggi ha sollevato controversie recenti, in base alla modalità di presentazione e l'importo da erogare. Il protocollo qui presentato fornisce un modo semplice ed efficace per fornire BMP-2 per studi in vitro su cellule. Si descrive come formare un monostrato auto-assemblato composto da un linker eterobifunzionale, e mostriamo la successiva fase vincolante per ottenere l'immobilizzazione covalente di rhBMP-2. Con questo approccio è possibile ottenere una presentazione sostenuta di BMP-2, pur mantenendo l'attività biologica della proteina. Infatti, l'immobilizzazione superficie di BMP-2 consente indagini mirate impedendo annunci aspecificheorption, riducendo la quantità di fattore di crescita e, in particolare, ostacolando rilascio incontrollato dalla superficie. Entrambi gli eventi di segnalazione a breve e lungo termine, innescato da BMP-2 si svolgono quando le cellule sono esposte a superfici che presentano covalentemente immobilizzato rhBMP-2, rendendo questo approccio adatto per studi in vitro sulle risposte cellulari ai BMP-2 stimolazione.
Introduction
Proteina morfogenetica ossea 2 (BMP-2) è un membro del fattore di crescita trasformante (TGF-β) famiglia e agisce come induttore del de novo formazione ossea e regolatore di diversi tessuti durante lo sviluppo embrionale e adulta omeostasi 1-3. Ogni monomero del omodimerica BMP-2 proteina biologicamente attiva contiene un motivo "cisteina nodo", che è altamente conservata in tutti BMP 4. Sei dei sette residui di cisteina formano legami disolfuro intramolecolari che stabilizzano ciascun monomero, mentre la settima cisteina è coinvolto nella dimerizzazione, formando un legame intermolecolare tra i due monomeri 5,6. Questo nodo di cisteina altamente conservati definisce la struttura tridimensionale della proteina BMP-2 e determina le proprietà uniche, come la resistenza al calore, denaturanti e acido pH 7-9. BMP-2 si lega a serina / treonina chinasi recettori transmembrana, inducendo così la trasduzione del segnale <sup> 10-12. A seconda della modalità di oligomerizzazione recettoriale, diverse vie di segnalazione vengono attivati: una cascata di segnalazione Smad-indipendente conduce ad induzione fosfatasi alcalina tramite segnalazione p38, mentre un percorso Smad-dipendente attivata risultati fosforilazione recettoriale in Smad traslocazione nucleare complesso e l'attivazione della trascrizione dei specifici geni bersaglio, come l'inibitore di differenziazione (Id) 12-14.
In osso, BMP-2 induce la differenziazione delle cellule staminali mesenchimali in osteoblasti, stimolando così la guarigione e de novo formazione di osso. Attualmente, ricombinante espresso BMP-2 è applicata clinicamente per migliorare la guarigione di siti fratturati. Una strategia comune in ingegneria del tessuto osseo è l'uso di fattori di crescita iniettabili, che è meno invasivo rispetto a sistemi di applicazione locale. Tuttavia, studi in vivo ed applicazioni cliniche hanno dimostrato che la breve emivita biologica, loc aspecificalizzazione e rapida domiciliazione del BMP-2 può portare a diversi problemi locali, ectopiche e sistemiche 15. Quindi, per ottenere una presentazione efficace, l'intrappolamento o immobilizzazione di BMP-2 all'interno o sul materiale necessario alla sua consegna locale e costante a sito bersaglio. Consegna sostenuta può essere ottenuto con metodi di conservazione non covalenti, come intrappolamento fisico, adsorbimento o complessazione di ioni 16. Tuttavia, è noto che adsorbimento non specifico di proteine su superfici può causarne la denaturazione delle molecole 17. Per il legame di fattori di crescita covalente, diversi tipi di supporti sono stati sviluppati negli ultimi dieci anni. L'uso di molecole bifunzionali che mirano linking amminici o carbossilici gruppi della proteina per esempio, è un tipo di approccio che non richiede necessariamente modificazione delle proteine per raggiungere la sua immobilizzazione. Infatti, mentre modificazione delle proteine offre il vantaggio di controllare l'orientamento proteine,l'introduzione di domini artificiali, tag e catene peptidiche specifiche del sito può alterare l'attività biologica di fattori di crescita 17. Così, per aggirare denaturazione dovuta all'interazione con il materiale di supporto, le superfici possono essere funzionalizzati anticipo, per esempio, con un monostrato auto-assemblato (SAM) di una molecola di collegamento, seguito da accoppiamento del fattore desiderato 18. Abbiamo usato un approccio basato SAM per immobilizzare covalentemente BMP-2 su una superficie di mira i suoi residui amminici liberi e abbiamo dimostrato che la proteina immobilizzata mantiene sia la sua attività biologica a breve e lungo termine 19. Questo protocollo fornisce un modo semplice ed efficace per fornire BMP-2 alle cellule per studi in vitro sui meccanismi che si verificano a livello della membrana cellulare e regolano segnalazione intracellulare responsabili per la segnalazione osteogenico.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo si descrive la preparazione di superfici funzionalizzate con bioattivo rhBMP-2. Questo approccio comprende due fasi: 1) la formazione iniziale di una auto-assemblaggio monostrato (SAM) di un linker bifunzionale sulla superficie di oro; 2) immobilizzazione covalente della proteina rhBMP-2. Nel lavoro precedente, abbiamo convalidato l'effettivo legame del linker bifunzionale e il fattore di crescita, e dimostrato che in superficie immobilizzato rhBMP-2 mantiene la sua attività biologica 19.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Prof. JP Spatz (Dipartimento di chimica biofisica, Università di Heidelberg e attrezzature dei nuovi materiali e dei Biosistemi, Istituto Max Planck per Sistemi Intelligenti, Stuttgart) per il suo supporto gentile. Il sostegno finanziario della Max-Planck-Gesellschaft e la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 a EAC-A.) Sono notevolmente riconosciuto.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 4-(dimethylamino)pyridin | Sigma-Aldrich | 522805 | |
| Acetone | AppliChem | A2282 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma-Aldrich | 674427 | |
| Dichlormethane | Merck | 106050 | |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | |
| Petroleum benzene | Merck | ||
| Glass coverslips | Carl Roth | M 875 | |
| Ethylacetate | AppliChem | A3550 | |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | |
| N,N-dimethylformamide | Carl Roth | T921 | |
| rhBMP-2 | R&D Systems | 355-BM | Carrier-free; expressed in E.coli |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Anti-rhBMP-2 | Sigma | B9553 | |
| Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Secondary antibody |
| Ampliflu Red assay | Sigma | 90101 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid | Gibco | 41966 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | Sterile filtered, cell culture tested |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na | Gibco | 25300 | |
| Glycine (0.1 M) | Riedel-de Haën | 33226 | |
| IGEPAL CA-630 (1%) | Sigma | I8896 | Lysis buffer (ALP assay)19 |
| Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) | Carl Roth | HNO3.2 | |
| Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) | Carl Roth | 3533.1 | |
| p-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | S0942 | Phosphatase substrate |
| Anti-mysin heavy chain (MHC) | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | MF20 | Monoclonal antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A11001 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Equipment | |||
| Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG | ||
| MED 020 Sputtercoating system | BAL-TEC AG | Coating conditions Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec |
|
| Tecan Infinite M200 Plate reader | Tecan |
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