Die kovalente Bindung von BMP-2 auf Oberflächen mit einem selbstorganisierten Monoschicht-Ansatz
Summary
Wir beschreiben ein Verfahren zum Erreichen effizienten Immobilisierung von BMP-2 auf die Oberflächen. Unser Ansatz beruht auf der Bildung einer selbstorganisierten Monoschicht, um die kovalente Bindung des BMP-2 mit seinem freien Aminresten zu erreichen basiert. Dieses Verfahren ist ein nützliches Werkzeug, um Signalisierung auf der Zellmembran zu studieren.
Abstract
Morphogenetisches Knochenprotein 2 (BMP-2) ist ein Wachstumsfaktor in der extrazellulären Matrix von Knochengewebe eingebettet ist. BMP-2 fungiert als Auslöser von mesenchymalen Zelldifferenzierung zu Osteoblasten und stimulieren damit Heilung und de novo Knochenbildung. Der klinische Einsatz von rekombinanten humanen BMP-2 (rhBMP-2) in Verbindung mit den letzten Gerüsten hat Kontroversen angehoben, bezogen auf die Darstellungsweise und die Menge geliefert werden. Die hier vorgestellten Protokoll bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit, BMP-2 in vitro-Untersuchungen an Zellen zu liefern. Wir beschreiben, wie eine selbstorganisierte Monoschicht, die aus einem heterobifunktionellen Linkers zu bilden, und zeigen die nachfolgende Bindungsschritt, um eine kovalente Immobilisierung von rhBMP-2 zu erhalten. Mit diesem Ansatz ist es möglich, eine anhaltende Präsentation von BMP-2 bei gleichzeitiger Beibehaltung der biologischen Aktivität des Proteins. In der Tat wird die Oberfläche Immobilisierung von BMP-2 können gezielte Untersuchungen durch Verhinderung unspezifischer AnzeigenDesorption, während die Verringerung der Menge an Wachstumsfaktor und, vor allem, behindern unkontrollierten Freisetzung von der Oberfläche. Beide kurz-und langfristigen Signalereignisse von BMP-2 ausgelöst stattfinden, wenn die Zellen auf Oberflächen präsentiert kovalent immobilisierten rhBMP-2 ausgesetzt, so dass dieser Ansatz geeignet für in-vitro-Studien an Zell-Antworten auf BMP-2 Stimulation.
Introduction
Morphogenetisches Knochenprotein 2 (BMP-2) ist ein Mitglied der transformierenden Wachstumsfaktor (TGF-β)-Familie und als Induktor der de novo Knochenbildung sowie Regulator mehreren Geweben während der embryonalen Entwicklung und Homöostase Erwachsenen 1-3. Jedes Monomer des biologisch aktiven homodimeren BMP-2-Protein enthält eine "Cystein-Knoten"-Motiv, das in allen hoch BMPs 4 konserviert ist. Sechs der sieben Cysteinreste eine intramolekulare Disulfidbindungen bilden, die jedes Monomer zu stabilisieren, während der siebte Cystein an der Dimerisierung beteiligt sind, die einen intermolekularen Bindung zwischen den beiden Monomeren 5,6. Diese hochkonservierten Cystein-Knoten definiert, die die dreidimensionale Struktur des BMP-2-Protein bestimmt und seine einzigartigen Eigenschaften, wie Beständigkeit gegen Hitze, Denaturierungsmittel und sauren pH 7-9. BMP-2-Bindung an Serin / Threonin-Kinase-Transmembran-Rezeptoren, wodurch die Signaltransduktion zu induzieren <sup> 12.10. Abhängig von der Art der Rezeptoroligomerisation werden unterschiedliche Signalwege aktiviert: ein Smad-unabhängige Signalkaskade führt zu der alkalischen Phosphatase-Induktions über p38-Signalisierung, während ein Smad-abhängigen Weg durch Rezeptor-Phosphorylierung führt Smad-Komplex nukleäre Translokation und Aktivierung der Transkription von Aktiv spezifischer Zielgene, wie z. B. der Inhibitor der Differenzierung (Id) 12-14.
In Knochen, BMP-2 induziert die Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen zu Osteoblasten, wodurch die Stimulierung der Heilung und de novo-Knochenbildung. Derzeit rekombinant exprimierten BMP-2 ist klinisch angewendet, um die Heilung von gebrochenen Seiten zu verbessern. Eine übliche Strategie im Knochengewebe ist der Einsatz von injizierbaren Wachstumsfaktoren, die zum lokalen Abgabesystemen weniger invasiv ist. In vivo-Studien und klinische Anwendungen haben gezeigt, dass die kurze biologische Halbwertszeit, unspezifische locsierung und schnelle lokale Clearance von BMP-2 kann sich auf mehrere lokale und systemische Probleme Eileiter 15 führen. Daher ist notwendig für die örtliche verzögerte Abgabe an der Zielstelle, um eine effektive Präsentation, das Einschließen oder Immobilisierung von BMP-2 in oder an Materialien zu erhalten. Anhaltende Abgabe kann mit nicht-kovalente Retentions Ansätze wie physikalischen Einschluß, Adsorption oder Ionenkomplex 16 erreicht werden. Es ist jedoch bekannt, dass unspezifische Adsorption von Proteinen an Oberflächen können die Ergebnisse in eine Denaturierung der Moleküle 17. Für die kovalente Bindung von Wachstumsfaktoren, wurden verschiedene Typen von Trägern in den letzten zehn Jahren entwickelt worden. Die Verwendung von bifunktionellen Verknüpfungsmoleküle, die Amino-oder Carboxylgruppen des Proteins beispiels Ziel ist eine Art von Ansatz, der nicht unbedingt erforderlich ist Proteinmodifikation seiner Immobilisierung zu erreichen. In der Tat bietet, während die Proteinmodifikation Vorteil der Steuerung Proteinorientierung,die Einführung der künstlichen Domänen-, Peptid-Tags und ortsspezifische Ketten verändern die biologische Aktivität von Wachstumsfaktoren 17. Somit, um die Denaturierung aufgrund der Wechselwirkung mit dem Trägermaterial zu umgehen, Oberflächen vorher funktionalisiert werden, beispielsweise mit einer selbstorganisierten Monoschicht (SAM) eines Verbindungsmoleküls, gefolgt von der Kopplung des gewünschten Faktor 18. Wir haben eine SAM-Ansatz, indem sie auf seiner freien Aminreste verwendet werden, um kovalent immobilisieren BMP-2 auf eine Oberfläche und haben gezeigt, dass das Protein immobilisiert sowohl die kurz-und langfristigen biologischen Aktivität 19 behält. Dieses Protokoll stellt eine einfache und effiziente Möglichkeit, BMP-2-Zellen für in vitro-Untersuchungen über die Mechanismen, die an der Zellmembran auf und regulieren intrazellulären Signalisierung für osteogene Signalisierung verantwortlich zu liefern.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir die Herstellung von Oberflächen mit bioaktiven rhBMP-2 funktionalisiert ist. Dieser Ansatz weist zwei Schritte auf: 1) die anfängliche Bildung einer selbstorganisierenden Monoschicht (SAM) eines bifunktionellen Linkers an der Goldoberfläche, 2) kovalente Immobilisierung von rhBMP-2-Proteins. In früheren Arbeiten, validiert man die effektive Bindung des bifunktionellen Linker und dem Wachstumsfaktor, und zeigten, dass auf der Oberfläche immobilisierten rhBMP-2 behält seine biolog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Prof. JP Spatz (Institut für Biophysikalische Chemie, Universität Heidelberg und der Abteilung Neue Materialien und Biosysteme, Max-Planck-Institut für Intelligente Systeme, Stuttgart) für die freundliche Unterstützung. Die finanzielle Unterstützung von der Max-Planck-Gesellschaft und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 EAC-A.) Sind ebenfalls sehr anerkannt.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 4-(dimethylamino)pyridin | Sigma-Aldrich | 522805 | |
| Acetone | AppliChem | A2282 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma-Aldrich | 674427 | |
| Dichlormethane | Merck | 106050 | |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | |
| Petroleum benzene | Merck | ||
| Glass coverslips | Carl Roth | M 875 | |
| Ethylacetate | AppliChem | A3550 | |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | |
| N,N-dimethylformamide | Carl Roth | T921 | |
| rhBMP-2 | R&D Systems | 355-BM | Carrier-free; expressed in E.coli |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Anti-rhBMP-2 | Sigma | B9553 | |
| Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Secondary antibody |
| Ampliflu Red assay | Sigma | 90101 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid | Gibco | 41966 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | Sterile filtered, cell culture tested |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na | Gibco | 25300 | |
| Glycine (0.1 M) | Riedel-de Haën | 33226 | |
| IGEPAL CA-630 (1%) | Sigma | I8896 | Lysis buffer (ALP assay)19 |
| Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) | Carl Roth | HNO3.2 | |
| Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) | Carl Roth | 3533.1 | |
| p-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | S0942 | Phosphatase substrate |
| Anti-mysin heavy chain (MHC) | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | MF20 | Monoclonal antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A11001 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Equipment | |||
| Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG | ||
| MED 020 Sputtercoating system | BAL-TEC AG | Coating conditions Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec |
|
| Tecan Infinite M200 Plate reader | Tecan |
References
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