Las células madre neurales cosechadas desde el cerebro adulto están aumentando utilizan en aplicaciones que van desde la investigación básica del desarrollo del sistema nervioso para la exploración de potenciales aplicaciones clínicas en medicina regenerativa. Esto hace que el control riguroso de las condiciones de aislamiento y cultivo utilizadas para cultivar estas células críticas para sonar los resultados experimentales.
Un trabajo reciente demuestra que el sistema nervioso central (SNC) la regeneración y la tumorigénesis involucra poblaciones de células madre (SCS) residentes en el cerebro adulto. Sin embargo, los mecanismos de estas células normalmente quiescentes emplean para garantizar el buen funcionamiento de las redes neuronales, así como su papel en la recuperación de la lesión y la mitigación de los procesos neurodegenerativos son poco comprendidos. Estas células residen en las regiones a que se refiere como "nichos" que ofrecen un ambiente sustentable que implica señales moduladoras tanto de la vascular y el sistema inmunológico. El aislamiento, el mantenimiento, y la diferenciación de las SC SNC bajo condiciones de cultivo empleadas que excluyen factores desconocidos, los hace accesibles a tratamiento por medios farmacológicos o genéticos, lo que proporciona una idea de su comportamiento in vivo. Aquí le ofrecemos información detallada sobre los métodos para la generación de culturas de las SC SNC desde distintas regiones del cerebro adulto y enfoques para evaluar su dpotencial ifferentiation en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos in vitro. Esta técnica produce una población de células homogénea como un cultivo en monocapa que se puede visualizar para estudiar las SC individual y su progenie. Además, se puede aplicar a través de diferentes sistemas de modelos animales y muestras clínicas, siendo utilizado previamente para predecir respuestas regenerativas en el sistema nervioso adulto dañado.
El dogma central de la neurobiología, establecido por las observaciones fundamentales de la citoarquitectura cerebral realizada por Ramón Y. Cajal hace más de un siglo, sostuvo que la neurogénesis es poco probable después de la adolescencia debido a la complejidad de las redes neuronales que se encuentran en el sistema nervioso central 1. A pesar del trabajo de Altman en la década de 1960, y más tarde de Kaplan, lo que demuestra que 3 H-timidina se pudo encontrar en neuronas maduras que indican que, de hecho, las neuronas se generaban en distintas áreas del cerebro adulto, el dogma continuó manteniendo 2, 3. Evidencia continuó creciendo con la investigación de Nottebohm describiendo los cambios estacionales en el número de neuronas presentes en los cerebros de pájaros cantores 4. No fue sino hasta 1999, cuando Gould et al. Trabajo publicado en la generación de neuronas en el hipocampo aumenta con el desempeño de las tareas de aprendizaje asociativo, en la rata, así como las observaciones de Kornack y Rakic demostraciónTing continuó la neurogénesis en el macaco adulto que el concepto de un cerebro menos rígida, más plástico, se reconoció 5, 6.
La búsqueda de la fuente celular para estas neuronas generadas de novo condujo al descubrimiento de una discreta población de células madre (SCS) que residen en áreas del cerebro conocida como nichos 7. La zona subventricular y la zona granular sub del hipocampo se considera que son las dos principales regiones neurogénicas 8,9. Las células aisladas de estos lugares muestran la característica clásica de las SC derivados embrionarios o fetales, la auto-renovación y diferenciación potencial. En el caso de las células madre neurales (NSC), que pueden diferenciarse en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos. Además, estos SC tinción positiva para los marcadores NSC fetales, tales como la proteína de los filamentos intermedia nestina 10. Trabajos más recientes destaca que las SC no puede estar limitada a estos two áreas, y están, de hecho, localizada en el cerebro como una población en gran parte inactiva de células estrechamente asociadas con la vasculatura 11.
Las observaciones de que las SC se movilizan en respuesta a la lesión sugiere la posibilidad de ser capaz de utilizar estas células con fines regenerativos para ayudar en la recuperación de los trastornos neurodegenerativos y los accidentes cerebrovasculares 12, 13. Esto no es a diferencia de la función que las células madre mesenquimales (MSCs) juegan en la curación de los tejidos conectivos, que se encuentran como células perivasculares que tienen el potencial de convertirse en osteoblastos, condrocitos, y células de tejido adiposo 14. Sin embargo, NSC no pueden ser cosechadas en la misma forma que las MSC de la médula ósea por aspiración de rutina y técnicas de centrifugación en gradiente de densidad y posteriormente utilizados en terapias basados en células autólogas. Como consecuencia, otras fuentes de células, tales como el uso de NSC fetales o precursores neuronales derivadas de embcélulas madre ryonic han explorado extensivamente en enfermedades de los animales y modelos de lesión con diversos grados de éxito 15. Tecnologías de células madre pluripotentes inducidas que utilizan fuentes de células somáticas ofrecen otra vía potencial para la producción de terapias basadas en células terapéuticamente útiles para una amplia gama de aplicaciones, la superación de la limitada disponibilidad y preocupaciones éticas con respecto al uso de células embrionarias y tejidos fetales 16. Sin embargo, la traducción clínica de estos hallazgos ha demostrado ser una tarea difícil, como se demuestra en las luchas de el tratamiento de diversas enfermedades neurológicas con terapéutica basada en SC enfoques 17,18, así como un camino tortuoso a la aprobación regulatoria. Como un enfoque alternativo, la introducción de los tratamientos farmacológicos específicos puede modular los números de NSC y facilitar la recuperación en los modelos de la enfermedad de Parkinson y accidente cerebrovascular 19. Cualquiera que sea la estrategia podría ser, entendiendo cómo manipular eficazmente estas célulasrequiere un sistema accesible in vitro.
Culturas del NSC se pueden realizar ya sea como agregado culturas, también conocidos como neuroesferas, o como una monocapa 8,20. Ambas técnicas se han utilizado ampliamente, lo que permite el establecimiento de condiciones de cultivo definidos, es decir, el uso de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) o factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) como una fuente de mitógeno, que proporcionan para la expansión de precursores multipotentes. Mientras que los cultivos de neuroesferas pueden ser más adecuados para el estudio de la capacidad de propagación clonal de un tipo de célula aislada, el sistema se ha demostrado que produce una población mixta de células durante la expansión 21. Además, la estructura cerrada de neuroesferas hace que la manipulación farmacológica de las células poco práctico, y la interpretación de la influencia de estos factores pueden tener podría ser confundido por el microambiente establecido dentro de la propia neuroesfera. Los cultivos monocapa, por otro lado, pueden serempleado en las pantallas de alto rendimiento de bibliotecas de pequeñas moléculas, que proporciona una poderosa herramienta para explorar los mecanismos de transducción de señales que regulan el crecimiento y la diferenciación SC y se abre la oportunidad de descubrir nuevos compuestos que se dirigen específicamente a esta población celular.
Como consecuencia, la capacidad de generar de forma reproducible culturas de NSC adultos de diferentes regiones de interés en el cerebro se puede utilizar en un amplio espectro de aplicaciones de investigación, que van desde los estudios del desarrollo del sistema nervioso central (SNC) para explorar enfoques de medicina regenerativa nuevos . El protocolo presentado aquí muestra cómo diseccionar y evaluar el potencial de diferenciación de las SC SNC aislados del cerebro de roedores adultos.
Muchos de los pasos críticos de éxito en el aislamiento, expansión y diferenciación de las células madre neurales del cerebro adulto se comparten en común con las técnicas de cultivo de tejidos. El objetivo a tener en cuenta es que los comités directivos nacionales aisladas del cerebro adulto deben mantener la mayor cantidad de sus características in vivo como sea posible (Figura 2J). A menudo, un equilibrio entre la necesaria cautela y velocidad adecuada necesita ser golpeado. Cuidado…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado (en parte) por el Helmholtz Alianza ICEMED – Imágenes y Enfermedades Metabólicas de curado ambiental, a través del Fondo de Iniciativa y Red de la Asociación Helmholtz, una beca de la Fundación Else Kroener-Fresenius, y una beca de la Deutsche Forschungsgemeinschaft ( SFB 655: Las células en los tejidos).
6-well tissue culture dishes | BD Biosciences | 353934 | ||
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P-3655 |
5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C). |
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Fibronectin | R&D Systems | 1030-Fn | Do not agitate stock solution | |
Filtration Apparatus | Corning Life Sciences | 430769 | ||
DMEM/F-12 | Mediatech | 10-090-CV | See note below for complete N2 media preparation | |
Apo-transferrin | Sigma-Aldrich | T-2036 | ||
Insulin | Sigma-Aldrich | I-0516 | ||
Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | 1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months) | |
Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S-5261 | 500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months) | |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | 100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months) | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-040-CV | ||
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | R&D Systems | 233-FB | Working concentration 20 ng/ml | |
Delta4 (Dll4) | R&D Systems | 1389-D4 | Working concentration 500 ng/ml | |
Angiopoetin 2 (Ang2) | R&D Systems | 623-AN | Working concentration 500 ng/ml | |
JAK Inhibitor | Calbiochem | 420099 | Working concentration 200 nM | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A-2058 | ||
15- and 50-ml Conical tubes | Corning Life Sciences | 430053, 430829 | ||
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution. Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light. | ||||
[header] | ||||
Immunofluorescence Reagents Table | ||||
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15719 | ||
Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D-9663 | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-8787 | ||
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D-8417 | 5 mg/ml stock solution in methanol | |
[header] | ||||
Primary Antibody Table | ||||
Nestin | Chemicon | MAB353 |
Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1 |
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Hes3 | Santa Cruz | sc-25393 |
Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG |
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Sox2 | R&D Systems | MAB2018 |
Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a |
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CNPase | Chemicon | MAB326 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1 |
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β-tubulin III (TUJ1) | R&D Systems | MAB1195 |
Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a |
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Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako North America | Z0334 |
Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit |
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[header] | ||||
Secondary Antibody Table | ||||
Alexa 568 | Invitrogen | A-21124 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1 |
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Alexa 488 | Invitrogen | A-21131 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a |
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Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 59883 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit |