Yetişkin Kemirgen Beyin konvansiyonel ve konvansiyonel olmayan Bölgelerinden Nöral Kök Hücreler Büyüyen
Summary
Yetişkin beyin hasat nöral kök hücreler sinir sistemi gelişiminin temel araştırma rejeneratif tıpta potansiyel klinik uygulamaları keşfetmek için çeşitli uygulamalar kullanılmaktadır artmaktadır. Bu deneysel sonuçların ses için kritik bu hücreleri büyümek için kullanılan yalıtım ve kültür koşullarında titiz kontrolü yapar.
Abstract
Son çalışma merkezi sinir sistemi (MSS) rejenerasyon ve tümörgenez kök hücre popülasyonları (AVM'ler) yetişkin beyin içinde ikamet içerdiğini göstermektedir. Ancak bu mekanizmalar normal olarak sakin hücrelerinin uygun sinir ağlarının işleyişini yanı sıra nörodejeneratif süreçlerin yaralanma ve azaltılması kurtarma rollerini sağlamak için istihdam çok az anlaşılmıştır. Bu hücreler, vasküler ve bağışıklık sistemi hem de düzenleyici sinyallerini içeren bir idame ettiren bir ortam sağlamak "niş" olarak adlandırılan bölgelerde bulunur. Bilinmeyen faktörler hariç belirlenen kültür koşulları altında MSS AVM'ler arasında izolasyon, bakım ve farklılaşma, böylece in vivo davranışları içgörü sağlayarak, farmakolojik veya genetik yollarla tedaviye onları erişilebilir kılar. Burada yetişkin beynin farklı bölgelerinden gelen MSS AVM'ler kültürlerini oluşturmak için yöntemler hakkında detaylı bilgi sunmak ve onların d değerlendirmek için yaklaşımlarnöronlar, astrositler ve in vitro oligodendrosit içine ifferentiation potansiyeli. Bu teknik, tek tek SC'ler ve döl çalışma görselleştirilebilir tek tabakalı bir kültür olarak homojen bir hücre popülasyonu elde edilir. Bundan başka, farklı hayvan modeli sistemlerinde ve klinik örnekler arasında uygulanabilir hasarlı yetişkin sinir sisteminin rejeneratif tepkileri tahmin etmek için daha önce kullanılan edilir.
Introduction
Bir yüzyıl önce Ramón Y. Cajal tarafından yapılan beyin hücre mimarisini temel gözlemler tarafından belirlenen nörobiyoloji santral dogma, ergenlik MSS 1. bulunan sinir ağlarının karmaşıklığı verilen sonra nöron olası olduğunu düzenledi. 1960'larda Altman iş, ve sonra Kaplan, 3 H-timidin aslında nöronlar yetişkin beynin farklı bölgelerinde üretilen belirten olgun nöronlarda bulunan olabileceğini gösteren rağmen, dogma 2, 3 tutmaya devam etti. Kanıt songbird beyinlerinde 4 mevcut nöronların sayısında mevsimsel değişiklikleri açıklayan Nottebohm araştırma ile bağlamaya devam etti. 1999 yılına kadar değildi zaman sıçan ilişkisel öğrenme görevlerin performansı yanı sıra Kornack ve Rakic gösteriler yo gözlemleri ile hipokampus artar nöronların nesil Gould ve ark. Yayınlanmış çalışmasıting, daha az sert, fazla plastik beyin kavramı, 5 kabul edilmiş yetişkin makak, 6 nörogenezi devam etmiştir.
Bu de novo oluşturulan nöronlar için hücresel kaynak için arama 7 nişler olarak adlandırılan beyin bölgelerinde bulunan kök hücreler (SCS) ayrı bir nüfusun keşfedilmesine yol açmıştır. Subventricular bölgesi ve hipokampus alt granül bölgesi, iki ana bölge nörojenik 8,9 olarak kabul edilir. Bu yerlerde izole hücreler klasik embriyonik veya fetal kaynaklı AVM'ler karakteristiği, kendini yenileme ve farklılaşma potansiyeli göstermektedir. Nöral kök hücreler (NSC'lerde) durumunda, bu nöronlar, astrositler ve oligodendrositler farklı olabilir. Ayrıca, bu SC'ler, ara filament protein Nestin 10 fetal NSC belirteçleri için pozitif leke. Daha yeni çalışmalar AVM'ler bu t sınırlı olmayabilir vurgulamaktadıralanları wo ve aslında sıkıca damar 11 ile bağlantılı bir hücre popülasyonu olarak büyük ölçüde hareketsiz beyin boyunca lokalizedir.
AVM'ler yaralanmaya yanıt olarak seferber olan gözlemler nörodejeneratif bozukluğu ve felç 12, 13 kurtarma yardım rejeneratif amaçlı bu hücreleri kullanmak mümkün olma olasılığını göstermektedir. Bu osteoblastlar, kıkırdaklan ve yağ hücreleri 14 olma potansiyeline sahip perivasküler hücreler olarak bulunan mezenkimal kök hücreler (MKH) bağ dokularının iyileşmesi oynadığı rol, farklı değildir. Bununla birlikte, NSC'lerde rutin aspirasyon ve yoğunluk dereceli santrifüj teknikleri ile kemik iliğinden MSC ile aynı şekilde hasat edilemez ve ardından otolog hücre bazlı terapiler olarak kullanılmaktadır. Bunun bir sonucu olarak, bu tür EMB türetilen fetal NSC'lerde veya nöronal öncülerinin kullanımı gibi diğer hücre kaynakları,ryonic kök hücreler yoğun bir başarı 15 dereceleri değişen hayvan hastalık ve yaralanma modellerinde araştırılmıştır. Somatik hücre kaynakları kullanarak uyarılmış pluripotent kök hücre teknolojileri kısıtlı olduğu ve embriyonik hücre ve fetal dokular 16 kullanımı ile ilgili endişeler etik üstesinden, geniş bir uygulama yelpazesi için terapötik açıdan yararlı, hücre bazlı terapiler üretilmesi için bir diğer potansiyel bir yol sunar. Ancak, bu bulguların klinik çeviri 17,18 yanı sıra, düzenleyici izni için dolambaçlı bir yol yaklaşımlar SC-temelli terapötik ile çeşitli nörolojik durumların tedavisi mücadelelerde gösterdiği gibi, zor bir görev olduğunu kanıtlamıştır. Alternatif bir yaklaşım olarak, belirli bir farmakolojik tedavilerin giriş NSC sayıda modüle eden ve Parkinson hastalığı ve felç 19 modellerinde kurtarma kolaylaştırabilir. Strateji, etkili bu hücreleri manipüle etmek için nasıl bir anlayış olabilir ne olursa olsunerişilebilir bir in vitro sistemi gerektirir.
NSC'lerde kültürleri, aynı zamanda olarak da bilinen neurospheres toplam kültürleri, ya bir tek tabaka ya da 8,20 olarak gerçekleştirilebilir. Her iki teknik, yaygın multipotent öncülerinin genişletilmesi için kültür koşulları sağlamak tanımlanan, bir mitojen kaynağı olarak Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) veya bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) yani kullanım kurulması için izin kullanılmıştır. Neurosphere kültürleri, bir izole edilmiş hücre tipi klonal yayılma yeteneği eğitim için daha uygun olsa da, sistem 21 genişlemesi sırasında hücrelerin karışık bir popülasyonunun üretilmesi için gösterilmiştir. Buna ek olarak, neurospheres kapalı yapısı, hücrelerin manipülasyonu farmakolojik pratik hale getirir, ve bu faktörler olabilir etkisi nedeniyle yorumlanması neurosphere kendi içinde kurulmuş olan mikro için eleştirilmiştir edilebilir. Tek tabakalı kültürleri, diğer taraftan, olabilir,SC büyümesini ve farklılaşmasını düzenleyen ve özellikle bu hücre popülasyonu hedef yeni bileşikler keşfetmek için bir fırsat açılır sinyal iletim mekanizmaları keşfetmek için güçlü bir araç sağlayarak, küçük molekül kütüphanelerin yüksek kapasiteli ekranlarında istihdam.
Sonuç olarak, yeniden üretilebilir beyinde ilgi farklı bölgelerinden yetişkin NSC'lerde kültürleri üretmek için yeteneği, merkezi sinir sistemi (MSS) gelişme çalışmalarından gelen yeni yaklaşımlar içinde rejeneratif ilaç kadar, araştırma uygulamaları geniş bir yelpazede kullanılabilir . Burada sunulan protokol incelemek ve erişkin kemirgen beyin izole MSS AVM'ler arasında farklılaşma potansiyelini değerlendirmek için nasıl gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Başarılı izolasyon, genişleme, ve yetişkin beyin nöral kök hücrelerin farklılaşması için kritik adımların birçok standart doku kültürü teknikleri ile ortak paylaşılır. Akılda tutulması amacı, yetişkin beyin izole NSC'lerde mümkün olduğunca in vivo özellikleri (Şekil 2J) kadar çok sayıda muhafaza gerektiğidir. Genellikle gerekli dikkat ve uygun hızı arasında bir denge vurdu gerekiyor. Kafatası beyin izolasyonu ile bakımı ilgi bölgenin tanımlanması ö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Helmholtz Derneği Girişimi ve Ağ Fonu, Else Kroener-Fresenius Vakfı'ndan hibe ve Deutsche Forschungsgemeinschaft bir hibe yoluyla Görüntüleme ve Kür Çevre Metabolik Hastalıklar, (- Bu çalışma Helmholtz İttifak ICEMED tarafından (kısmen) finanse edildi SFB 655: dokulara hücreler).
Materials
| 6-well tissue culture dishes | BD Biosciences | 353934 | ||
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P-3655 |
5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C). |
|
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-Fn | Do not agitate stock solution | |
| Filtration Apparatus | Corning Life Sciences | 430769 | ||
| DMEM/F-12 | Mediatech | 10-090-CV | See note below for complete N2 media preparation | |
| Apo-transferrin | Sigma-Aldrich | T-2036 | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-0516 | ||
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | 1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months) | |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S-5261 | 500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months) | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | 100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months) | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-040-CV | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | R&D Systems | 233-FB | Working concentration 20 ng/ml | |
| Delta4 (Dll4) | R&D Systems | 1389-D4 | Working concentration 500 ng/ml | |
| Angiopoetin 2 (Ang2) | R&D Systems | 623-AN | Working concentration 500 ng/ml | |
| JAK Inhibitor | Calbiochem | 420099 | Working concentration 200 nM | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A-2058 | ||
| 15- and 50-ml Conical tubes | Corning Life Sciences | 430053, 430829 | ||
| Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution. Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light. | ||||
| [header] | ||||
| Immunofluorescence Reagents Table | ||||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15719 | ||
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D-9663 | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-8787 | ||
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D-8417 | 5 mg/ml stock solution in methanol | |
| [header] | ||||
| Primary Antibody Table | ||||
| Nestin | Chemicon | MAB353 |
Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1 |
|
| Hes3 | Santa Cruz | sc-25393 |
Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG |
|
| Sox2 | R&D Systems | MAB2018 |
Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a |
|
| CNPase | Chemicon | MAB326 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1 |
|
| β-tubulin III (TUJ1) | R&D Systems | MAB1195 |
Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a |
|
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako North America | Z0334 |
Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit |
|
| [header] | ||||
| Secondary Antibody Table | ||||
| Alexa 568 | Invitrogen | A-21124 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1 |
|
| Alexa 488 | Invitrogen | A-21131 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a |
|
| Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 59883 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit |
|
References
- Cajal, R. Y. . Comparative Study of Sensory Areas of the Human Cortex. , (1899).
- Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. J. Comp. Neurol. 124, 319-335 (1965).
- Kaplan, M. S., Hinds, J. W. Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs. Science. 197, 1092-1094 (1977).
- Nottebohm, F. Neuronal replacement in adulthood. Ann. N.Y. Acad. Sci. 457, 143-161 (1985).
- Gould, E., Reeves, A. J., Graziano, M. S., Gross, C. G. Neurogenesis in the neocortex of adult primates. Science. 286, 548-552 (1999).
- Kornack, D. R., Rakic, P. Continuation of neurogenesis in the hippocampus of the adult macaque monkey. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5768-5773 (1999).
- Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 357-365 (2008).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Luskin, M. B. Restricted proliferation and migration of postnatally generated neurons derived from the forebrain subventricular zone. Neuron. 11, 173-189 (1993).
- Lendahl, U., Zimmerman, L. B., McKay, R. D. CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. Cell. 60, 585-595 (1990).
- Androutsellis-Theotokis, A., et al. Targeting neural precursors in the adult brain rescues injured dopamine neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13570-13575 (2009).
- Jin, K., et al. Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4710-4715 (2001).
- Zhang, R. L., Zhang, Z. G., Chopp, M. Ischemic stroke and neurogenesis in the subventricular zone. Neuropharmacology. 55, 345-352 (2008).
- Caplan, A. I. Why are MSCs therapeutic? New data: new insight. J. Pathol. 217, 318-324 (2009).
- Goldman, S. Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system. Nat. Biotechnol. 23, 862-871 (2005).
- Sun, N., Longaker, M. T., Wu, J. C. Human iPS cell-based therapy: considerations before clinical applications. Cell Cycle. 9, 880-885 (2010).
- Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 6, e1000029 (2009).
- Lindvall, O., Bjorklund, A. Cell therapeutics in Parkinson’s disease. Neurotherapeutics. 8, 539-548 (2011).
- Kittappa, R., Bornstein, S. R., Androutsellis-Theotokis, A. The Role of eNSCs in Neurodegenerative Disease. Mo.l Neurobiol. , (2012).
- Cattaneo, E., McKay, R. Identifying and manipulating neuronal stem cells. Trends Neurosci. 14, 338-340 (1991).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).
- Duarte, A., et al. Dosage-sensitive requirement for mouse Dll4 in artery development. Genes Dev. 18, 2474-2478 (2004).
- Maisonpierre, P. C., et al. Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis. Science. 277, 55-60 (1997).
- Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
- Alderson, R. F., Alterman, A. L., Barde, Y. A., Lindsay, R. M. Brain-derived neurotrophic factor increases survival and differentiated functions of rat septal cholinergic neurons in culture. Neuron. 5, 297-306 (1990).
- Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
- Ourednik, J., Ourednik, V., Lynch, W. P., Schachner, M., Snyder, E. Y. Neural stem cells display an inherent mechanism for rescuing dysfunctional neurons. Nat. Biotechnol. 20, 1103-1110 (2002).
- Ryu, J. K., Cho, T., Wang, Y. T., McLarnon, J. G. Neural progenitor cells attenuate inflammatory reactivity and neuronal loss in an animal model of inflamed AD brain. J. Neuroinflammation. 6, 39 (2009).
- Androutsellis-Theotokis, A., et al. Angiogenic factors stimulate growth of adult neural stem cells. PLoS One. 5, e9414 (2010).
- Park, D. M., et al. Hes3 regulates cell number in cultures from glioblastoma multiforme with stem cell characteristics. Sci. Rep. 3, 1095-1010 (2013).
- Poser, S. W., Shostak, S., et al. Ch. 5. Cancer Stem Cells – The Cutting. , 89-110 (2011).
- Androutsellis-Theotokis, A., Rueger, M. A., Mkhikian, H., Korb, E., McKay, R. D. Signaling pathways controlling neural stem cells slow progressive brain disease. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 403-410 (2008).
