Summary
Neuroblast migration er en grundlæggende begivenhed i postnatal neurogenesis. Vi beskriver en protokol til effektiv mærkning af neuroblasts ved in vivo postnatal elektroporation og efterfølgende visualisering af deres migration ved hjælp af time-lapse billeddannelse af akutte hjernen skiver. Vi inkluderer en beskrivelse af den kvantitative analyse af neuroblast dynamik ved video tracking.
Abstract
Den subventricular zone (SVZ) er en af de vigtigste neurogene nicher i den postnatale hjerne. Her neurale progenitorceller formere sig og give anledning til neuroblaster i stand til at bevæge sig langs rostralt vandrende strøm (RMS) mod lugtekolben (OB). Denne lange afstande migration er nødvendig for den efterfølgende modning af nyfødte neuroner i OB, men de molekylære mekanismer, der regulerer denne proces er stadig uklart. Undersøge signalveje, der kontrollerer neuroblast motilitet ikke blot kan hjælpe med at forstå et grundlæggende skridt i neurogenese, men også have terapeutisk regenerative potentiale, da evnen af disse neuroblasts at målrette hjernen ramt af skader, slagtilfælde eller degeneration.
I dette manuskript beskriver vi en detaljeret protokol for in vivo postnatal elektroporation og efterfølgende time-lapse billeddannelse af neuroblast migration i mus RMS. Fødselsdepression elektroporation kan effektivt transficere SVZ stamfaderceller, som igen genererer neuroblaster migrerer langs RMS. Brug konfokal spinning disk time-lapse mikroskopi om akutte hjerne skivekulturer kan neuroblast migration skal overvåges i et miljø, der ligner in vivo tilstand. Desuden kan neuroblast motilitet spores og analyseres kvantitativt. Som et eksempel beskriver vi, hvordan du bruger in vivo postnatal elektroporation af en GFP-udtrykkende plasmid til at mærke og visualisere neuroblasts migrerer langs RMS. Elektroporering af shRNA eller CRE recombinase-udtrykkende plasmider i betingede knockout mus med den LoxP Systemet kan også anvendes til at målrette gener af interesse. Farmakologisk manipulation af akut hjerne skivekulturer kan udføres for at undersøge den rolle, som forskellige signalmolekyler i neuroblast migration. Ved at koble in vivo elektroporation med time-lapse imaging, håber vi at forstå de molekylære mekanismer, der styrer neuroblast motilitet og bidrage til at udvikleling af nye tilgange til at fremme hjernens reparation.
Introduction
I pattedyrs hjerne optræder dannelsen af nye neuroner (neurogenese) efter fødslen hovedsageligt to områder, den subventrikulære zone (SVZ) af de laterale ventrikler og subgranular zone i den tandede gyrus af hippocampus 1. Betydelige beviser indsamlet i de seneste år understøtter en afgørende rolle for postnatal neurogenese i hippocampus og olfaktoriske pære hukommelsesfunktioner 1-3. Vigtigere er det, postnatal neurogenese rummer også terapeutiske potentiale på grund af sit forhold med degenerative neurologiske lidelser, og evne til neuroblasts at migrere til skadelidte steder i hjernen 4-6.
Den subventricular zone (SVZ) har for nylig vist sig som en afgørende neurogen niche. SVZ-afledte neuroblasts migrere til lugtekolben (OB) via rostralt vandrende strøm (RMS), hvilket gør dette den længste migration proces i postnatal hjerne 1,7,8. Pattedyrs SVZ / RMS / OB system er blevet ennyttig model til at studere forskellige trin i neurogenese, såsom proliferation, migrering og differentiering 1,8. Mange vækstfaktorer og ekstracellulære signaler regulerer SVZ neurogenesis og migration langs RMS, men de intracellulære molekylære mekanismer er langt fra at være fuldt forstået 1,9. Korrekt migration langs RMS er afgørende for den efterfølgende modning af nyfødte neuroner 10. Derudover har nogle undersøgelser vist, at SVZ-afledte neuroblasts kan migrere ud af RMS til hjerneskade sites 4-6,11-13. Således undersøger signalering mekanismer, der regulerer neuroblast migration er grundlæggende ikke blot at forstå neurogenesis, men også for potentielle terapeutiske anvendelser.
Her beskriver vi en detaljeret protokol til at mærke SVZ neurale progenitorer ved in vivo postnatal elektroporation og overvåge deres vandring langs RMS i akutte hjerne skivekulturer bruge time-lapse spinning disk konfokal microscopy. Elektroporation er meget udbredt i udviklingsmæssige undersøgelser fra embryonale til voksne stadier 14-18. Det er et kraftfuldt værktøj til at målrette og manipulere SVZ neurale stamfædre og repræsenterer en billigere og betydeligt hurtigere alternativ til stereotaktisk injektion af virale vektorer eller generering af transgene modeller 1,15,19,20. Det er en relativt enkel procedure, som ikke behøver operation, og har høje overlevelsesrater. Elektroporation af shRNA eller CRE recombinase-udtrykkende plasmider i mus genetiske modeller, der anvender LoxP systemet kan bruges til at målrette gener af interesse eller for at opnå permanent mærkning af SVZ stamceller repræsenterer således et nyttigt redskab for voksne neurogenese studier 21,22.
Imaging RMS neuroblast migration i den intakte hjerne er stadig udfordrende på grund af de nuværende tekniske begrænsninger. Dog kan denne proces overvåges ved hjælp af konfokal spinning disk time-lapse mikroskopi af akutte hjernen skiver, som giver en passende system ligner in vivo tilstand også modtagelig for farmakologisk manipulation 23,24. Kobling in vivo postnatal elektroporation med time-lapse imaging vil lette forståelsen af de molekylære mekanismer, der styrer neuroblast motilitet og bidrage til udviklingen af nye metoder til fremme hjernens reparation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne procedure er i overensstemmelse med det britiske indenrigsministerium forordninger (Animal Scientific Procedures Act, 1986). Forskerne bør følge de retningslinjer, der er fastlagt og godkendt af deres institutionelle og nationale organisationer dyr.
1.. Fødselsdepression Elektroporation
1.1. Fremstilling af glaskapillarer DNA Solution og elektroporator
- Forbered trukket glaskapillarer (OD: 1,5 mm, ID: 0,86 mm) til DNA-injektion. (Vejledende indstillinger for en Sutter P-97 kapillar aftrækker er: Varme 283 Træk 50, Velocity 90; Time 50). Lav et mærke på kapillarrøret, der svarer til et volumen på cirka 2 pl.
- Indstil spændingen på elektroporator til 5 firkantede pulser, 50 msek / puls på 100 V, med 850 msek intervaller (100 V, puls på 50 msek, puls OFF 850 msek puls 5).
- Fortyndet høj renhed (OD 260/280> 1,80) endotoksin-frit plasmid-DNA til en endelig koncentration på 1-2 pg / plmed endotoxin fri Tris-EDTA-buffer eller PBS. Det anbefales at tilføje 0,1% Fast Green til DNA-opløsningen (farvestoffet skal spredes i ventriklen, når held injiceret).
- Forbered 5-7 mm elektroder, elektrode gel og varme op varmepuden.
1.2. Elektroporation
- Fjern en postnatal dag 2 mus hvalp fra bur og bedøver det med isofluran inhalation (ved et flow på ~ 0,6 L / min).
- Efter ca 1 min, fastlægge tilstanden af bedøvelse ved hjælp af foden knivspids respons. Hvis der opstår nogen bevægelse, fortsæt med intraventrikulær injektion.
- Load kapillær nål med 1-2 pi DNA under anvendelse af en aspirator rør forbundet til kapillarrøret.
- Under en kold lyskilde, holde hovedet af hvalpen mellem tommel-og pegefinger på din mindre dominerende hånd. Lidt trække huden tilbage på hovedet for at hjælpe identifikationen af retten injektionsstedet.
- Overvej en lige linje mellem øjet og than craniometric skelsættende lambda (figur 1A). Sæt kapillær nål på omkring en tredjedel af længden af denne linje fra lambda (ca. 1 mm fra linjen midtpunktet) 15. Sæt kapillarrøret omkring 2 mm dyb, og sørg for at undgå dybe indtrængen i hjernen.
- Injicer plasmid ved at blæse langsomt gennem munden (en sprøjte forbundet til kapillarrøret kan også anvendes). Under denne procedure, skal du sikre dine fingre ikke anvende for meget pres på hjernen, da dette kan forhindre vellykket plasmid injektion.
- Stop injektion en minimal mængde af DNA-opløsningen tilbage i kapillarrøret. Det er tilrådeligt at tilføre mindre end 1 ml for at undgå skadelig forøgelse i det intrakranielle tryk.
- Coat begge elektroder med gel og placere dem med den positive side på den laterale side af halvkuglen, hvor DNA blev injiceret (figur 1A). For DNA i den rostral SVZ, placere elektroder lidt rostral tilinjektionsstedet. Varierende elektrode position kan opnå regional specificitet elektroporation i forskellige områder af SVZ 22,25.
- Indled aktuelle overførsel ved at trykke på pulsen fodpedal. Når elektroporation er færdig, skal du kontrollere spændingen på elektroporator display (spænding værdier bør ikke være under 90 V, da lavere spænding værdier korrelerer med dårlig elektroporation effektivitet).
- Genoplive hvalpen under ilt på varmepude i et par minutter og returnere det til buret, placere den væk fra moderen. Sørg for, at moderen henter hvalpen og genforener den med resten af kuldet. Efter elektroporation forlader hvalpe med deres mor i 4-7 dage før næste trin.
2. Fremstilling af akut hjerne skivekulturer
2.1. Udarbejdelse af løsninger og værktøjer
- Følgende løsninger er påkrævet (det er også muligt at bruge high-glucose DMEM for at dissekere og billedbehandling17):
Dissection Medium (500 ml)
Geys balancerede medier - 500ml
45% glucose - 5ml
Film Medium (10 ml)
45% glucose - 0.110 ml
HEPES 1 M - 0,100 ml
Pen / Strep - 0,100 ml
FCS - 0.500 ml
B27 - 0,100 ml
Glutamin - 0,200 ml
Dulbecco Modified Eagle Medium (phenolrød-fri) - 8,89 ml - Varm op film medium ved 37 ° C.
- Placer Millicell indsættes i et 35 mm glasbund kultur skål indeholdende 1 ml film medium og anbringes i en fugtig inkubator ved 37 ° C / 5% CO2.
- Forbered vibratome tilbehør (skruetrækker, kammer, barberblade, lim).
- Forbered Dissektionsværktøj: saks, lille spatel, lige pincet.
- Forbered værktøjer til håndtering af skiver: lille pensel eller blød pode loop (størrelse: 10 ul), plastik Pasteur-pipetter, en is boks og flere 6 cm plast retter.
- Forkøling dissektion mediumved 2-4 ° C.
2.2. Udarbejdelse af hjerneskiver
- Fyld en 6 cm skål med forkølet dissektionsmedium og placere den på is (for at holde nyslået skiver).
- Efter halsdislokation bruge en saks til at halshugge musen hvalp. Fjern hovedbunden med en skalpel, skæres kraniet langs midten sagittale sutur fra OB til lillehjernen og fjern forsigtigt kranie flapper med en pincet. Sørg for, at hele hjernen er udsat og omhyggeligt dissekere det ud ved hjælp af en spatel, der tager særlig omhu for ikke at beskadige vævet. Dissektion skal gøres omhyggeligt, men på samme tid meget hurtigt (mindre end et minut, hvis muligt). Cervikal dislokation er vores foretrukne metode, fordi terminal anæstesi med lægemidler / gas anæstesi kan påvirke vandrende egenskaber af neuroblasts og sund tilstand af hjernen skivekulturer, som skal afbildes relativt hurtigt følgende animalske offer.
- Hemisect hjernen med en Razeller blade (figur 2). Kassér ikke-injicerede halvkugle eller anvendelse til andre eksperimenter.
- Placer en lille stykke tape på vibratome holderen og bruge den minimale nødvendige mængde lim til at fastgøre hjernehalvdel på toppen af det (figur 2). Dette forhindrer beskadigelse af holderen overflade på grund af gentagne lim applikationer.
- Lad limen tørre i et par sekunder.
- Placer holderen i vibratome bakke fyldt med forkølet dissektion løsning. Punkt lugtekolben imod kniven (figur 2).
- Begynd at skære hjernehalvdel ved hjælp af passende indstillinger. Følgende parametre anbefales: skivetykkelse 300 m; hastighed ~ 3-5, frekvens ~ 9. Høj frekvens og lav hastighed anbefales at undgå skader på skive.
- Saml skiver med en lille pensel eller en blød inokulere løkke. Kun beholde skiver med synligt OB (normalt 2-3 skiver / hjernen). Typisk skive indeholder de fleste af RMS can findes på ~ 300 um fra bundfladen.
- Tjek skiver under en standard fluorescerende mikroskop for GFP signal (og sørg for at vende dem over til at kontrollere fluorescens på begge sider), og vælge dem, der viser lyse fluorescens langs det meste af RMS.
2.3. Dyrkning Brain Skiver
- I en cellekultur hætte, skæres væk mest caudale tredjedel af hjernen skive og fjerne eventuelle lim spor ved hjælp af fine lige pincet eller en mikrodissektion skalpel.
- Fint aspirer skive med en plastik Pasteur pipette (skære spidsen af pipetten til at skabe en større åbning, vil dette undgå at beskadige skive) og placere den på midten af en forvarmet Millicell insert.
- Sørg for, at siden med den klareste fluorescerende signal er placeret i kontakt med Millicell indsætte (til billeddannelse med en inverteret mikroskop).
- Fjern overskydende dissektion opløsning på toppen af indsatsen med en pipette.
- Lad skivekulturer tilafvikle i et 37 ° C / 5% CO2 inkubator i mindst 1 time før billeddannelse.
3. Time-lapse Imaging af neuroblast Migration
- Mindst 2 timer før billedbehandling, tænde Perkin Elmer UltraViewVoX konfokal spinning disk-system, omvendt Nikon Ti-E mikroskop, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2), afkølet digital CCD kamera og varmesystem (Solent Scientific) indstillet på konstant temperatur på 37 ° C.
- Åbn Volocity software Acquisition modul og klik på "nemlig" knappen og vælg laser (r) til billeddannelse.
- Indenfor 2 timer af hjernens skive forberedelse, placere glasbund skål indeholdende hjernen skive i imaging kammer på mikroskopet scenen.
- Brug et Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 mål under den relevante fluorescerende lys til at vælge og fokusere på området for den skive, der vil blive afbildet (f.eks første faldende del af RMS lige efter injektionsstedet eller Elbow region RMS, eller lige efter albuen før neuroblaster træder OB).
- Indstil time-lapse billeddannelse med følgende tiltag:
- På mikroskopet, skal du klikke på knappen L100 til at tillade laserscanning af prøven.
- I Volocity åbne Ultraview Laser Changer ved at vælge den rette laser (fx 488 nm laser til GFP).
- Indstil eksponeringstiden (normalt mellem 100-500 ms) og laseren intensitet (sædvanligvis 20-30%) afhængigt af intensiteten af det fluorescerende signal.
- Juster billedet digital forstærkning for at forbedre celle visualisering.
- Vælg z-stak interval på billedet inde i hjernen skive (normalt over en 100-120 um interval). Vælg et interval med et passende antal isolerede celler for at undgå eventuelle overlapninger så meget som muligt (dette vil lette den efterfølgende sporing analyse).
- Vælg afstanden mellem hver z-stak billede (sædvanligvis 2-4 um).
- Vælg den tid, interval mellem hver z-stak capture (fx 3 min) og den samlede imaging varighed (fx 3 timer).
- Klik på "Gem"-ikonet for at gemme ændringerne i de billeddannende parametre.
- Tryk på optageknappen for at starte billeddannelse.
- Alternativ billeddannelse af kontrol-og forsøgsprøver (f.eks køretøj / medicinsk behandling, eller forskellige elektroporeret plasmider) i hele samme dag.
4.. Analyserer neuroblast Migration
- I Volocity Kvantificering modulet åbne den ønskede bibliotek oprettes efter udløbet af en time-lapse eksperiment. Vælg "Extended Focus" fra øverste venstre boks (figur 4A, trin 1).
- Klik på fanebladet "Målinger" for at vise den Measurement vindue (figur 4A, trin 2).
- En liste over opgaver er synlig i nederste venstre hjørne af skærmen. Træk "Spor" (til stede under rubrikken "Diverse" i bunden aflisten) på ovenstående rum. Dette vil bede åbningen af et nyt vindue kaldet "Spor" i øverste venstre del af skærmen (Figur 4A, trin 3).
- Vælg "Point" fra "Input" fanen i Track (Figur 4A, trin 4).
- Klik på værktøjet Punkt (figur 4A, trin 5).
- Begynd at spore migrerende neuroblast ved at klikke med musen på det centrale område af cellen kroppen og holde spore celle bevægelse, indtil det sidste tidspunkt for time-lapse er nået (for eksempel punkt nummer 61 for en 3 timer lang film) .
- At indhente data vælge "Make Måling Item" fra menuen Målinger (figur 4B, trin 6-7). Et vindue vises i midten af skærmen.
- I dette vindue skal du vælge "En ny måling element, som hedder:" og skrive et navn (figur 4C, trin 8). Husk at vælge "Alle tidspunkter" valgmulighed før PREssing OK (figur 4C, trin 9). En måling emne fil vises under time-lapse fil og vil indeholde parametre for kvantitativ analyse (fx migration afstand, hastighed, fordrivelse og forskydning rente).
- Dobbeltklik på målingen element filen for at åbne den som et vindue (figur 4D, trin 10).
- At visualisere de enkelte spor analyserede celler, skal du vælge "sporet Point" fra "Display" muligheder (figur 4D, trin 11).
- Højreklik på måling Item fil og eksportere den som en tekstfil, som derefter kan importeres i programmer som Excel til at analysere migration parametre.
- For at måle bevægelser mellem hinanden følgende rammer og pauser fra hver enkelt celle under optagelserne periode, i målingen Item fil vælge fra "Display" options "Point" eller "befolkninger" og klik på id (hvert spor har et unikt id). Eksporter den resulterende fil ved fortsætteposition som forklaret i trin 4.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mærkning af SVZ-afledte vandrende neuroblaster kan observeres langs RMS, normalt 4-8 dage efter en vellykket elektroporation (figur 1B). Kan også vælges længere tidspunkter, men i mindre celler findes i RMS, da de fleste af dem vil være trådt OB. Neuroblasts begynde at optjene typisk morfologi og funktioner af modne granulceller i OB omkring 2-3 uger efter elektroporation (ikke vist). Efter dyrkning for ~ 1 time, kan hjernen skiver fra elektroporerede museungers pålideligt filmede i op til 3-4 timer. Som tidligere rapporteret 23,26 kan neuroblaster at vise komplekse migration dynamik (figur 3 og video 1), som kan være kvantitativt analyseret ved hjælp af celle-sporing (figur 4).
Figur 1. Postna tal in vivo elektroporation. (A) Skematisk tegning af in vivo elektroporation af postnatal dag 2 mus pup. En stiplet linje (rød), der forbinder øjet til craniometrical skelsættende lambda tjener som en positionel markør for kapillær indsættelse. Indsprøjtningen punkt er angivet som en grøn prik. Grå ovale former angiver elektrode position som beskrevet i Boutin et al. 15 (B) sagittal mus forhjerne skive immunfarvet for GFP 5 dage efter elektroporering af GFP-udtrykkende plasmid. SVZ-afledte migrerer neuroblasts er synlige langs RMS og nogle af dem er begyndt at nå OB. Ctx: cortex; SVZ: subventricular zone RMS: rostrale vandrende stream, OB: lugtekolben. Bar, 400 mM. Klik her for at se større billede .
n "src =" / files/ftp_upload/50905/50905fig2.jpg "width =" 500px "/>
Figur 2. Skematiske trin i forberedelsen af akutte hjerne skivekulturer til billeddannelse. (A) caudale intrahemispheric nedskæringer (stiplede linjer) er udført på en frisk dissekeret hjerne. (B) Den elektroporerede hjernehalvdel er placeret på en vibratome holder. (C) Sagittale skiver opnås med en vibratome og observeret under en standard fluorescerende mikroskop . (D) Skiver med de bedste GFP signal dyrkes i mindst 1 time på en Millicell indsætte inde i et glas-bund fad, og (E), senere anbringes i en miljømæssig kammer til billeddannelse med en omvendt konfokal spinning disk system. Klik her at se større billede .
les/ftp_upload/50905/50905fig3.jpg "width =" 500px "/>
Figur 3. Time-lapse imaging migrere neuroblasts. (A) roterende skive time-lapse billeder af neuroblaster taget fra en mus sagittal hjernesnit 5 dage efter elektroporering af GFP-udtrykkende plasmid. Billeder er 1 time fra hinanden. Hvert panel er en z-stak projektion af 28 på hinanden følgende billeder, 4 mM hinanden. Pilespidser indikerer 4 repræsentative neuroblasts migrerer langs RMS mod lugtekolben (placeret ude af billedet i nederste højre hjørne). (B) Repræsentative trækruter opnået fra time-lapse billeder af de 4 neuroblasts fremhævet i (A). (C) Graf, der viser afstanden migrerede med tiden med 2 repræsentative neuroblasts. Celler vise en typisk saltatory motile adfærd. Bar, 70 mM. Klik her for at se større billede .
Figur 4.. Sporing analyse af migrere neuroblasts. Sekventielle trin bruges til at spore migrerende neuroblasts hjælp Volocity software. Se tekst for detaljeret beskrivelse. Klik her for at se større billede .
Video 1:. Time-lapse-billeddannelse af migrerende neuroblaster Filmen viser et udsnit af muse RMS med GFP-mærkede migrerer neuroblaster opnået 5 dage efter elektroporering af GFP-udtrykkende plasmid. OB er placeret ud af udsigt til nederste højre hjørne. Konfokal z-stakke blev fanget på en roterende disk konfokal med et 20x objektiv hver 3 min til 3 timer i løbet af en 120 um interval. Playing hastighed: 10 billeder / sek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Effektiv migration af neurale stamfædre langs RMS sikrer deres efterfølgende modning i funktionelle neuroner 10. Fremtrædende strømme af neurale forfædre rettet mod OB er synlige i menneskets barndom og er tilbøjelige til at spille en vigtig rolle i den tidlige postnatale udvikling menneskelige hjerne 27. Desuden er disse celler i stand til målsteder af hjernen påvirkes af skade og neurodegeneration 4,28. At være i stand til at overvåge i realtid effekten af genmanipulation på neuroblast dynamik bliver afgørende for fuldt ud at forstå, hvordan neuroblast bevægelse styres og reguleres.
Her har vi beskrevet en protokol til at overvåge SVZ-afledte neuroblast migration ved at koble in vivo postnatal elektroporation med time-lapse konfokal spinning disk mikroskopi af akutte hjerne skivekulturer. Konkret har vi vist, hvordan migrerer neurale stamfædre kan mærkes ved elektroporere i SVZ et plasmid ENCoding GFP. Afhængigt af formålet med undersøgelsen kan der anvendes flere typer af plasmider (f.eks tillader ekspression af andre fluorescerende proteiner eller co-ekspression af vildtype / mutant-proteiner af interesse, CRE-rekombinase eller shRNA sammen med fluorescerende proteiner). Vi anbefaler stærkt ved hjælp af plasmider, der indeholder kylling beta actin CAG promotor 29 for in vivo-ekspression. Billeddannelse af hjerneskiver opnået fra elektroporerede dyr kan også anvendes til at overvåge den radiale vandring af neurale stamceller i OB ved længere tidspunkter (7-10 dage) efter elektroporation 30.
Efter en indledende periode med praksis, bliver in vivo postnatal elektroporation en meget pålidelig metode, der giver robust neuroblast mærkning for både time-lapse billedbehandling og immunfluorescens analyse. Desuden er denne teknik giver en grundlæggende fordel i forhold til transgene mus, der udtrykker fluorescerende proteiner under neuroblast promotorer,hvor størstedelen af neuroblasts er mærket. Faktisk elektroporation tillader sparsom mærkning af neuroblasts, således at detaljerede analyser af deres morfologi og migration dynamik. Sammenlignet med stereotaktisk levering af virusvektorer 31, denne teknik er billigere, hurtigere og er meget veltolereret af museunger. Den største ulempe består i, at den er begrænset til tidlige postnatale faser. Faktisk anbefaler vi kraftigt at bruge postnatal dag 2 museunger, da vi observerede et betydeligt fald i mærkning effektivitet på senere tidspunkter, hvor virale levering metoder bliver mere passende 31. Dog kan strategier som elektroporering af CRE-udtrykkende plasmider i passende mus genetiske modeller anvendes til at studere neurogenese i voksen stages 22.
To-foton kan standard konfokal, spinning disk konfokal og bredt felt mikroskopi alle bruges til at visualisere neuroblast migration 17,23,24. Spinning disk conomdrejningspunkt mikroskopi er et billigere alternativ til to-foton mikroskopi. Det giver 3D-billedbehandling ved højere hastighed gennem flere z fly, begrænse fotoblegning sammenlignet med standard konfokal mikroskopi og tilbyde en højere opløsning end bredt felt fluorescensimagografi 31-33. Størstedelen af migrerende neuroblasts har en klart synlig soma og en meget dynamisk førende proces tippet med en vækst kegle.
Som beskrevet af andre 17, ville have en perfusionskammer tillade direkte vurdere virkningerne af kontrol og medicinsk behandling på samme hjerne skive. Mens vi overveje dette en vigtig fordel, protokollen beskrevet her viser, at det ikke er absolut nødvendigt for cellernes levedygtighed til perfundere skiver med iltet kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) eller høj glukose DMEM 17,33. Desuden, ved hjælp af et inverteret mikroskop letter objektiv manipulation forhold til opretstående mikroskoper udstyret med nedsænkning i vand mål.Vi fandt, at ved hjælp af en 20X langdistance-mål er en optimal kompromis, der muliggør sporing af en god antallet af celler (som regel 25-40 per skive) og producerer gode billeder opløsning (Video 1). Automatisk sporing er også muligt, men det er ikke altid pålidelige. Af denne grund anbefaler vi visuelt og om nødvendigt, manuel kontrol af automatiske tracking data. Højere forstørrelse billeddannelse af enkelte neuroblaster kan udføres under anvendelse af et Nikon Fluor DIC M/N2 40X/0.80W mål. Den frit tilgængelige ImageJ plugin MTrackJ kan også bruges til at måle basisspor statistik 33, men nogle rå datafangst filer kan være uforenelige med denne software og kan have brug for at blive omdannet til egnede formater til analyse, som i visse tilfælde kan være tidskrævende . Kombinationen af indsamling og analyse af billedet moduler leveres af Volocity software giver en øjeblikkelig overgang fra billedoptagelse / behandling til kvantitativ analyse af vandrende parameterbreve (hastighed, forskydning osv.), som let kan visualiseres i en række grafer (fx som udviser folkevandringsmønstre / distance / retningsbestemmelse / hastighed / persistens / tidsforbrug immobile, osv.).
Neuroblasts vise en saltatory bevægelse, skiftevis vandrende til stationære faser 34,35 (figur 3C). I lyset af det faktum, at stationære faser kan være mellem 4-10 min 32, mener vi, at tage billeder hver 3 min er et godt kompromis til at følge migrerende neuroblasts med minimal belysning og solskader. Vi ser sjældent celler stopper for mere end 6 min, og opdager, at over en 3-timers periode, er de generelt bruger i gennemsnit 30 minutter immobile. Ifølge tidligere rapporter neuroblasts har en gennemsnitlig hastighed på 60-100 um / time og en gennemsnitlig bugtet indeks (faktisk forskydning over udvandrede afstand), lidt over 0,6 23,36, hvilket er i overensstemmelse med vores observationer. Typicallieret, omkring 60% af cellerne viser en "vandrende" adfærd (f.eks efter næsten lineære stier migration, med en bugtet indeks mellem 0,6-1), og 20-25% er "sonderende" (med en bugtet indeks mellem 0-0,4) mens de resterende ~ 20% kan klassificeres som "mellemliggende" (skiftevis vandrende og sonderende etaper med en bugtet indeks mellem 0,4-0,6).
Vi erkender, at der stadig er begrænsninger i denne teknik, da vi ikke kan filme neuroblasts mere end 3-4 hr uden iagttagelse væsentlige ændringer i deres motilitet. Filme varighed kan øges ved at sænke imaging frekvens (men dette vil påvirke nøjagtigheden af analysen migration), samt ved at vedtage en perfusionskammer at optimere miljøforhold for billeddannelse. Men protokollen beskrevet her, herunder en 3-4 timers imaging periode udgør et passende kompromis med indsamling af tilstrækkelige data til kvantitativ analyse afmigration. Faktisk så langt vi har formået at påvise de virkninger, om migration ved proteinoverekspression / nedregulering 37 eller ved farmakologisk manipulation efter sammenligning med passende kontroller (Sonego og Zhou, upublicerede resultater).
Afslutningsvis kombination af in vivo postnatal elektroporation med spinning disk imaging af hjernens skivekulturer, er et effektivt redskab til at overvåge dynamikken i neuroblast migration i et system, der ligner det in vivo miljø, der tilbyder mulighed for at foretage en tilbundsgående undersøgelse af de molekylære mekanismer, der styrer neuroblast motilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
MS og YZ understøttes af KCL og KCL Kina ph.d.-stipendier. MO blev finansieret af en bioteknologi og biologiske Sciences Research Council Ph.d. studentship. Vi takker Masaru Okabe og Jun-ichi Miyazaki til PCX-EGFP plasmid og Alain Chedotal og Athena Ypsilanti for værdifuld rådgivning om elektroporation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
- Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction? Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
- Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
- Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
- Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
- Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
- Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
- Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
- Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
- Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
- Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883 (2008).
- Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174 (2012).
- dal Maschio, M., M,, et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960 (2012).
- Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A.
- Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30 (2011).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13 (2011).
- Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease. Neuroscience. 127, 319-332 (2004).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
- Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
- Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
- Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
