Summary
Migrazione neuroblasti è un evento fondamentale nella neurogenesi postnatale. Descriviamo un protocollo per l'etichettatura efficiente dei neuroblasti di elettroporazione in vivo postnatale e la successiva visualizzazione della loro migrazione utilizzando time-lapse imaging di fette di cervello acuto. Includiamo una descrizione per l'analisi quantitativa delle dinamiche neuroblasti di monitoraggio video.
Abstract
La zona subventricolare (SVZ) è uno dei principali nicchie neurogenici nel cervello postnatale. Qui, progenitori neurali proliferano e danno luogo a neuroblasti in grado di muoversi lungo il torrente migratorio rostrale (RMS) verso il bulbo olfattivo (OB). È necessaria Questa migrazione a lunga distanza per la successiva maturazione dei nuovi neuroni nel OB, ma i meccanismi molecolari che regolano questo processo sono ancora poco chiare. Indagare le vie di segnalazione che controllano la motilità neuroblast può aiutare non solo a capire un passo fondamentale nella neurogenesi, ma hanno anche terapeutico potenziale rigenerativo, data la capacità di questi neuroblasti per indirizzare siti cerebrali colpite da lesioni, ictus, o la degenerazione.
In questo manoscritto si descrive un protocollo dettagliato per l'elettroporazione in vivo postnatale e conseguente time-lapse imaging della migrazione neuroblasti nelle RMS del mouse. Elettroporazione postnatale può efficacemente transfect SVZ progenitorecellule, che a loro volta generano neuroblasti migrano lungo le RMS. Utilizzando la microscopia confocale spinning disk time-lapse sulle culture acuti fetta cervello, la migrazione neuroblasti può essere monitorato in un ambiente molto simili alla condizione in vivo. Inoltre, neuroblast motilità possono essere monitorati e analizzati quantitativamente. Come esempio, si descrive come utilizzare in vivo postnatale elettroporazione di un plasmide GFP che esprimono per etichettare e visualizzare neuroblasti migrano lungo le RMS. Elettroporazione di shRNA o CRE-ricombinasi esprime plasmidi in topi knockout condizionali che impiegano il sistema loxP può anche essere utilizzato per geni di interesse bersaglio. Manipolazione farmacologica di culture acute fetta cervello può essere eseguita per studiare il ruolo di molecole di segnalazione diverse nella migrazione neuroblasti. Accoppiando in elettroporazione in vivo con time-lapse imaging, speriamo di comprendere i meccanismi molecolari che controllano neuroblast motilità e contribuire allo sviluppozione di nuovi approcci per promuovere la riparazione del cervello.
Introduction
Nel cervello dei mammiferi, la generazione di nuovi neuroni (neurogenesi) si verifica dopo la nascita principalmente in due regioni, la zona subventricolare (SVZ) dei ventricoli laterali e la zona subgranulare nel giro dentato dell'ippocampo 1. Notevole prove raccolte negli ultimi anni sostiene un ruolo fondamentale per la neurogenesi postnatale in funzioni di memoria lampadina ippocampo e olfattive 1-3. È importante sottolineare che la neurogenesi postnatale detiene anche potenziale terapeutico a causa della sua relazione con malattie neurologiche degenerative, e la capacità di neuroblasti di migrare verso siti danneggiati nel cervello 4-6.
La zona subventricolare (SVZ) ha recentemente emerso come una nicchia neurogena cruciale. Neuroblasti SVZ-derivati migrano verso il bulbo olfattivo (OB) attraverso il flusso migratorio rostrale (RMS), rendendo questo il processo di migrazione più lunga del 1,7,8 cervello postnatale. Il / RMS / sistema OB mammiferi SVZ è diventato unmodello utile per studiare varie fasi neurogenesi, quali la proliferazione, migrazione e differenziazione 1,8. Molti fattori di crescita e segnali extracellulari regolano la neurogenesi SVZ e la migrazione lungo le RMS, ma i meccanismi molecolari intracellulari sono ben lungi dall'essere pienamente compreso 1,9. La corretta migrazione lungo le RMS è di fondamentale importanza per la successiva maturazione dei neuroni neonati 10. Inoltre, alcuni studi hanno dimostrato che neuroblasts SVZ-derivate possono uscire dalle RMS a siti lesioni cerebrali 4-6,11-13. Così, indagando la migrazione neuroblasti meccanismi di segnalazione di regolazione è fondamentale non solo per capire neurogenesi, ma anche per le potenziali applicazioni terapeutiche.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per etichettare progenitori neurali SVZ da elettroporazione in vivo postnatale e monitorare la loro migrazione lungo le RMS culture acuti fetta cervello usando time-lapse confocale disco rotante microscopy. L'elettroporazione è ampiamente usato in studi sullo sviluppo embrionale da a stadi adulti 14-18. Si tratta di un potente strumento per indirizzare e manipolare progenitori neurali SVZ e rappresenta un'alternativa più economica e molto più veloce di iniezione stereotassica di vettori virali o generazione di modelli transgenici 1,15,19,20. Si tratta di una procedura relativamente semplice che non richiede l'intervento chirurgico e ha alti tassi di sopravvivenza. Elettroporazione di shRNA o CRE-ricombinasi esprimono plasmidi in modelli genetici di topo che impiegano il sistema loxP può essere utilizzato per indirizzare i geni di interesse o per ottenere l'etichettatura permanente dei progenitori SVZ, rappresentando così uno strumento utile per gli studi di neurogenesi adulta 21,22.
Imaging RMS migrazione neuroblasti nel cervello intatto è ancora difficile a causa di limitazioni tecniche. Tuttavia, questo processo può essere monitorato tramite disco confocale spinning time-lapse microscopia di fette di cervello acuto, che forniscono un adeguato system molto simili alla condizione in vivo anche suscettibili di manipolazione farmacologica 23,24. Accoppiamento elettroporazione in vivo postnatale con time-lapse imaging faciliterà la comprensione dei meccanismi molecolari che controllano neuroblast motilità e contribuire allo sviluppo di nuovi approcci per promuovere la riparazione del cervello.
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Protocol
Questa procedura è in conformità con i regolamenti interni del Regno Unito Office (Procedure di animale scientifici Act, 1986). Gli scienziati devono seguire le linee guida stabilite e approvate dalle loro organizzazioni di regolamentazione nazionali o istituzionali animali.
1. Postnatale elettroporazione
1.1. Preparazione di vetro Capillari, Soluzione DNA e Elettroporatore
- Preparare capillari tirato vetro (OD: 1,5 millimetri, ID: 0,86 millimetri) per l'iniezione di DNA. (Impostazioni indicativi per una capillare estrattore Sutter P-97 sono: Heat 283; Tirare 50; Velocity 90; ora 50). Fare un segno sul capillare corrispondente ad un volume di circa 2 ml.
- Impostare la tensione del elettroporatore a 5 impulsi quadrati, 50 msec / impulso a 100 V, con intervalli di 850 msec (100 V, impulso ON 50 msec, impulso OFF 850 msec, impulsi 5).
- Diluire elevata purezza (OD 260/280> 1,80) privo di endotossine DNA plasmidico ad una concentrazione finale di 1-2 mg / mLcon endotossine liberare tampone Tris-EDTA o PBS. Si consiglia di aggiungere 0,1% Verde veloce per la soluzione di DNA (il colorante si diffonda nel ventricolo quando iniettato con successo).
- Preparare gli elettrodi 5-7 mm, il gel dell'elettrodo e riscaldare il rilievo di riscaldamento.
1.2. Elettroporazione
- Rimuovere un postnatale giorno 2 del mouse cuccioli da gabbia e anestetizzare che per inalazione isoflurano (in un flusso di ~ 0,6 L / min).
- Dopo circa 1 min, determinare lo stato di anestesia utilizzata la risposta piede pinch. Se si verifica nessun movimento, procedere con l'iniezione intraventricolare.
- Caricare ago capillare con 1-2 ml di DNA utilizzando un tubo aspiratore collegato al capillare.
- Sotto una sorgente di luce fredda, tenere la testa del cucciolo tra il pollice e l'indice della mano meno dominante. Leggermente tirare indietro la pelle sulla testa per aiutare l'identificazione del punto di iniezione di destra.
- Si consideri una linea virtuale tra l'occhio e tegli craniometrico punto di riferimento lambda (Figura 1A). Inserire l'ago capillare a circa un terzo della lunghezza di questa linea dalla lambda (circa 1 mm dal punto centrale linea 15). Inserire il capillare circa 2 mm di profondità, avendo cura di evitare la penetrazione in profondità nel cervello.
- Iniettare plasmide soffiando lentamente attraverso la bocca (una siringa collegata al capillare può anche essere utilizzato). Durante questa procedura, assicurarsi che le dita non stanno applicando troppa pressione sul cervello, in quanto questo può impedire iniezione plasmide successo.
- Arrestare iniezione quando una quantità minima di soluzione di DNA viene lasciato nel capillare. E 'opportuno iniettare meno di 1 ml per evitare deleterio aumento della pressione intracranica.
- Coat entrambi gli elettrodi con gel e posizionarle con il lato positivo sul lato laterale dell'emisfero in cui il DNA è stato iniettato (Figura 1A). Per l'incorporazione nel DNA rostrale SVZ, posto gli elettrodi leggermente rostrale alpunto di iniezione. Variando la posizione degli elettrodi può raggiungere specificità regionale di elettroporazione in diverse aree del SVZ 22,25.
- Avviare il trasferimento corrente premendo il pedale del pedale a impulsi. Quando l'elettroporazione è completa, controllare la tensione sul display elettroporatore (valori di tensione non deve essere inferiore a 90 V, in quanto i valori di tensione più bassa correlazione con scarsa efficienza elettroporazione).
- Rianimare il cucciolo sotto ossigeno a rilievo di riscaldamento per un paio di minuti e tornare alla gabbia, mettendo lontano dalla madre. Assicurarsi che la madre recupera il cucciolo e si riunisce con il resto della cucciolata. Dopo l'elettroporazione, lasciare i cuccioli con la madre per 4-7 giorni prima di passo successivo.
2. Preparazione delle Culture acuta del cervello Slice
2.1. Preparazione di soluzioni e strumenti
- Le seguenti soluzioni sono richiesti (è anche possibile utilizzare DMEM ad alto glucosio per dissezione e l'imaging17):
Dissection Medium (500 ml)
Supporti Balanced Gey - 500ml
45% di glucosio - 5ml
Movie Medio (10 ml)
45% di glucosio - 0,110 ml
HEPES 1 M - 0.100 ml
Pen / Strep - 0.100 ml
FCS - 0.500 ml
B27 - 0.100 ml
Glutammina - 0.200 ml
Dulbecco Modified Eagle Medium (fenolo libero-rosso) - 8,89 ml - Warm up medio di film a 37 ° C.
- Posizionare Millicell inserisce in un piatto di coltura inferiore 35 millimetri di vetro contenente 1 ml di terreno di film e posto in un incubatore umidificato a 37 ° C / 5% di CO 2.
- Preparare vibratome accessori (cacciavite, camera, lame di rasoio, colla).
- Preparare strumenti di dissezione: forbici, spatola, pinze diritte.
- Preparare gli strumenti per la gestione fette: piccolo pennello morbido o un'ansa da inoculo (dimensioni: 10 ml), pipette Pasteur di plastica, un contenitore di ghiaccio e vari piatti di plastica 6 centimetri.
- Preraffreddare il mezzo dissezionea 2-4 ° C.
2.2. Preparazione del cervello fette
- Riempire un piatto di 6 centimetri con mezzo dissezione preraffreddata e posizionarlo sul ghiaccio (per mantenere fette appena tagliate).
- A seguito di dislocazione cervicale, usare le forbici per decapitare il cucciolo mouse. Rimuovere il cuoio capelluto con un bisturi, tagliare il cranio, lungo la sutura sagittale dalla OB al cervelletto e rimuovere delicatamente i lembi cranici con pinze. Assicurarsi che l'intero cervello è esposto e con attenzione sezionare fuori con una spatola, facendo particolare attenzione a non danneggiare il tessuto. La dissezione deve essere fatto con attenzione, ma allo stesso tempo molto velocemente (meno di un minuto, se possibile). Dislocazione cervicale è il nostro metodo preferito perché anestesia terminali con anestetici farmaci / gas possono influenzare le proprietà migratorie dei neuroblasti e lo stato di salute del cervello fetta culture, che devono essere ripreso in tempi relativamente brevi seguente sacrificio di animali.
- Hemisect il cervello con un razo lama (Figura 2). Eliminare emisfero non iniettato o utilizzare per altri esperimenti.
- Posizionare un pezzo di nastro sul supporto vibratome e utilizzare la quantità minima necessaria di colla per attaccare l'emisfero cerebrale su di esso (Figura 2). Questo impedisce danneggiamento della superficie titolare causa di colla applicazioni ripetute.
- Lasciate asciugare la colla per alcuni secondi.
- Collocare supporto nel vassoio vibratome riempito con una soluzione di dissezione preraffreddata. Puntare il bulbo olfattivo verso la lama (Figura 2).
- Iniziare a tagliare l'emisfero cerebrale utilizzando le impostazioni appropriate. I seguenti parametri sono raccomandati: spessore di strato di 300 micron; velocità ~ 3-5; frequenza ~ 9. Alta frequenza e bassa velocità sono raccomandati per prevenire danni alla fetta.
- Raccogliere le fette con un piccolo pennello o un un'ansa da inoculo morbido. Tenere le fette solo con OB visibile (solitamente 2-3 fette / cervello). In genere, la fetta che contiene la maggior parte delle RMS can disponibile sul ~ 300 micron dalla superficie inferiore.
- Controllare le fette sotto un microscopio a fluorescenza standard per il segnale GFP (avendo cura di capovolgere su di loro per controllare la fluorescenza su entrambi i lati), e scegliere quelle che mostrano fluorescenza lungo la maggior parte delle RMS.
2.3. Coltura Fette cervello
- In una cappa di coltura cellulare, tagliare via il terzo più caudale della fetta cervello e rimuovere eventuali tracce di colla con una pinzetta diritte sottili o un bisturi microdissezione.
- Delicatamente aspirare la fetta con una pipetta Pasteur di plastica (tagliata la punta della pipetta per creare un'apertura più grande, questo eviterà di danneggiare la fetta) e collocarlo al centro di un Millicell preriscaldata inserto.
- Assicurarsi che il lato con il segnale fluorescente luminosa viene posta in contatto con il Millicell inserto (per l'imaging con un microscopio invertito).
- Rimuovere la soluzione dissezione eccesso sulla sommità dell'inserto con una pipetta.
- Lasciare culture fetta distabilirsi in un C 5% CO 2 incubatore 37 ° / per almeno per 1 ora prima di imaging.
3. Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti
- Almeno 2 ore prima di imaging, accendere il sistema Perkin Elmer UltraViewVoX disco confocale filatura, invertito microscopio Nikon Ti-E, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2) raffreddato CCD digitale, e il sistema di riscaldamento (Solent Scientific) impostato in costante temperatura di 37 ° C.
- Aprire il modulo di acquisizione software Volocity e fare clic sul pulsante "Viz" e selezionare il laser (s) per l'imaging.
- Entro 2 ore di cervello preparazione fetta, mettere il piatto fondo di vetro contenente la fetta cervello nella camera di imaging sul palco microscopio.
- Utilizzare un obiettivo Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 sotto la luce fluorescente appropriato per selezionare e mettere a fuoco l'area della sezione che verrà ripreso (ad esempio, la prima parte discendente della RMS subito dopo il sito di iniezione, o l'Elbow regione RMS, o subito dopo il gomito prima di neuroblasti entrare nel OB).
- Impostare il time-lapse imaging con le seguenti azioni:
- Al microscopio, fare clic sul pulsante L100 per consentire la scansione laser del campione.
- In Volocity, aprire la ULTRAVIEW Laser Changer selezionando il laser appropriato (ad esempio 488 nm laser per GFP).
- Impostare il tempo di esposizione (di solito tra 100-500 msec) e l'intensità del laser (di solito 20-30%) a seconda dell'intensità del segnale fluorescente.
- Regolare l'immagine guadagno digitale per migliorare la visualizzazione delle cellule.
- Selezionare l'intervallo di z-stack per l'immagine all'interno della fetta cervello (di solito nel corso di un intervallo di 100-120 micron). Scegliere un intervallo con un adeguato numero di cellule isolate per evitare possibili sovrapposizioni il più possibile (questo faciliterà la successiva analisi di inseguimento).
- Selezionare la spaziatura tra ogni immagine z-stack (di solito 2-4 micron).
- Scegliere il tempo di interval tra ogni cattura z-stack (ad esempio 3 min) e la durata totale di imaging (ad esempio 3 ore).
- Fare clic sull'icona "Salva" per salvare le modifiche ai parametri di imaging.
- Premere il pulsante di registrazione per iniziare imaging.
- Immagini alternate di campioni di controllo e sperimentali (per esempio veicolo / trattamento farmacologico o diversi plasmidi elettroporate) durante lo stesso giorno.
4. Analizzando neuroblasti migrazione
- Nel modulo Volocity Quantitation, aprire la libreria desiderata creato dopo aver completato un esperimento di time-lapse. Selezionare "Focus avanzata" dalla casella in alto a sinistra (Figura 4A, punto 1).
- Fare clic sulla scheda "di misure" per visualizzare la finestra di misura (Figura 4A, punto 2).
- Un elenco di attività è visibile in basso a sinistra dello schermo. Trascinare "Track" (presente nella sezione "Varie" voce in fondol'elenco) nello spazio sopra. Questo richiederà l'apertura di una nuova finestra chiamata "Track" nella parte superiore sinistra della schermata (Figura 4A, punto 3).
- Selezionare "Punti" dal tab "Input" nella finestra Track (Figura 4A, punto 4).
- Fai clic sullo strumento Point (4A, punto 5).
- Iniziare a monitorare la migrazione di neuroblasti cliccando con il mouse sulla zona centrale del corpo cellulare e tenere traccia il movimento delle cellule fino all'ultimo punto ora del time-lapse viene raggiunta (ad esempio il punto numero 61 per un film di 3 ore lungo) .
- Per ottenere dati scegliete "Make Voce di misura" dal menu Misure (Figura 4B, punti 6-7). Apparirà una finestra al centro dello schermo.
- In questa finestra, selezionare "Un nuovo elemento di misura denominata:" e digitare un nome (Figura 4C, punto 8). Ricordate di selezionare l'opzione "tutti i momenti" prima pressing OK (Figura 4C, punto 9). Un file oggetto di misurazione apparirà sotto il time-lapse e conterrà i parametri di analisi quantitativa (ad esempio la distanza di migrazione, velocità, spostamento e velocità di spostamento).
- Fare doppio clic sul file elemento di misurazione per aprirlo come una finestra (Figura 4D, punto 10).
- Per visualizzare le singole tracce di cellule analizzate, scegliere "cingolati Point" dalle opzioni del "Display" (Figura 4D, passo 11).
- Fare clic destro sul file Misura Item ed esportarlo come file di testo, che può essere importato in programmi come Excel per analizzare i parametri di migrazione.
- Per misurare movimenti tra fotogrammi consecutivi e pause effettuate da ciascun cellulare durante il periodo di riprese, nel file di misura Item selezionare tra le opzioni "Display", "Point" o "popolazioni" e clicca su ID (ogni brano ha un ID univoco). Esportare il file risultante da procederezione come spiegato al punto 4.10.
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Representative Results
Etichettatura dei neuroblasti migratori SVZ-derivati può essere osservato lungo le RMS, di solito 4-8 giorni dopo il elettroporazione di successo (Figura 1B). Punti di tempo più lunghi possono anche essere scelti, ma meno cellule si trovano nelle RMS poiché la maggior parte di loro sono entrati nel OB. Neuroblasti cominciare ad acquisire tipica morfologia e le caratteristiche di cellule granulari mature nella OB intorno 2-3 settimane dopo l'elettroporazione (non mostrato). Dopo coltura per ~ 1 ora, fettine di cervello di cuccioli di topo elettroporate possono essere esposte in modo affidabile fino a 3-4 ore. Come precedentemente riportato 23,26, neuroblasti possono visualizzare dinamiche migratorie complessi (Figura 3 e video 1), che può essere quantitativamente analizzato utilizzando cellule inseguimento (Figura 4).
Figura 1. Postna in tal elettroporazione in vivo. (A) Schema di elettroporazione in vivo di una postnatale giorno 2 del mouse cucciolo. Una linea tratteggiata (rosso) che collega l'occhio al limite lambda craniometrical serve come un marcatore di posizione per l'inserimento capillare. Il punto di iniezione è indicato come un punto verde. Forme ovali grigi indicano la posizione degli elettrodi come descritto in Boutin et al. 15 (B) fetta prosencefalo del mouse sagittale immunostained per GFP 5 giorni dopo l'elettroporazione di un-GFP che esprimono plasmide. Neuroblasti migrano SVZ-derivati sono visibili lungo le RMS e alcuni di loro hanno iniziato a raggiungere l'OB. CTX: cortex; SVZ: zona subventricolare, RMS: rostrale del flusso migratorio; OB: bulbo olfattivo. Bar, 400 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Figura 2. Passaggi schematici nella preparazione di culture fetta cerebrale acuta per l'imaging. (A) caudale e tagli intrahemispheric (linee tratteggiate) vengono eseguite su un cervello appena sezionato. (B) L'emisfero cervello elettroporate è posto su un supporto vibratome. (C) fette sagittali si ottengono con un vibratome e osservati al microscopio a fluorescenza di un . (D) Fette con il miglior segnale GFP sono coltivate per almeno 1 ora su un Millicell inserire all'interno di un piatto fondo di vetro, e (E) successivamente immesse in una camera climatica per l'imaging da un confocale invertito filatura disco di sistema. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Figura 3. Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti. (A) del disco Spinning time-lapse immagini di neuroblasti presi da una sezione sagittale del cervello del mouse 5 giorni dopo l'elettroporazione di un-GFP che esprimono plasmide. Le immagini sono 1 ora di distanza. Ogni pannello è una proiezione z-stack di 28 immagini consecutive 4 micron a parte. Punte di freccia indicano 4 neuroblasts rappresentativi migratori lungo le RMS verso il bulbo olfattivo (che si trova fuori dal quadro nell'angolo in basso a destra). (B) percorsi migratori Rappresentante ottenuti da time-lapse imaging dei 4 neuroblasti evidenziate in (A). (C) Il grafico mostra la distanza di migrazione con il tempo di 2 neuroblasti rappresentativi. Le cellule mostrano un tipico comportamento mobili saltatory. Bar, 70 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 4. Monitoraggio analisi della migrazione di neuroblasti. Passi sequenziali utilizzati per tenere traccia neuroblasti migrano utilizzando il software Volocity. Si prega di vedere il testo per una descrizione dettagliata. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Video 1:. Time-lapse imaging di neuroblasti migrano Il filmato mostra una sezione di RMS mouse con neuroblasti migrano GFP-etichettata ottenuti 5 giorni dopo l'elettroporazione di un plasmide GFP che esprimono. L'OB si trova fuori dalla vista verso l'angolo in basso a destra. Confocale z-stacks sono stati catturati su un confocale disco rotante con un obiettivo 20X ogni 3 min per 3 ore in un intervallo di 120 micron. Giocare Velocità: 10 fotogrammi / sec.
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Discussion
Migrazione efficiente di progenitori neurali lungo le RMS garantisce la loro successiva maturazione in neuroni funzionali 10. Flussi importanti di progenitori neurali diretti verso l'OB sono visibili nella prima infanzia umana e possono svolgere un ruolo importante nei primi mesi del postnatale sviluppo del cervello umano 27. Inoltre, queste cellule sono in grado di siti del cervello colpite da lesioni e neurodegenerazione 4,28 bersaglio. Essere in grado di monitorare in tempo reale l'effetto della manipolazione genetica sulle dinamiche neuroblasti diventa essenziale per comprendere appieno come il movimento neuroblast è guidato e regolato.
Qui abbiamo descritto un protocollo per monitorare la migrazione neuroblasti SVZ-derivati con l'accoppiamento di elettroporazione in vivo postnatale con time-lapse microscopia confocale disco rotante di culture acute fetta cervello. In particolare, abbiamo mostrato come la migrazione di progenitori neurali può essere etichettato dal electroporating nella SVZ un enc plasmideoding GFP. A seconda dello scopo dello studio, possono essere utilizzati diversi tipi di plasmidi (per esempio fissando espressione di altre proteine fluorescenti o co-espressione di tipo selvaggio / proteine mutanti di interesse, CRE ricombinasi, o shRNA insieme a proteine fluorescenti). Si consiglia vivamente di utilizzare i plasmidi contenenti il pollo beta actina CAG promoter 29 per l'espressione in vivo. Imaging di fette di cervello ottenuti da animali elettroporate può anche essere utilizzato per monitorare la migrazione radiale dei progenitori neurali nel OB a tempi più lunghi (7-10 giorni) dopo l'elettroporazione 30.
Dopo un periodo iniziale di pratica, in vivo postnatale elettroporazione diventa un metodo molto affidabile, permettendo l'etichettatura robusto neuroblast sia per il time-lapse imaging e di analisi di immunofluorescenza. Inoltre, questa tecnica offre un vantaggio fondamentale rispetto topi transgenici che esprimono proteine fluorescenti sotto promotori specifici neuroblasti,dove la maggioranza dei neuroblasti sono etichettati. Infatti, elettroporazione consente l'etichettatura sparse di neuroblasti, permettendo così un'analisi dettagliata della loro dinamica morfologia e migrazione. Rispetto alla consegna stereotassica di vettori virali 31, questa tecnica è più conveniente, più veloce ed è molto ben tollerato dai cuccioli di topo. Lo svantaggio principale consiste nel fatto che essa è limitata a fasi postnatali. Infatti, vi consigliamo di utilizzare giorno dopo la nascita di 2 cuccioli di topo, in quanto abbiamo osservato una diminuzione sostanziale in termini di efficienza di etichettatura in tempi successivi, quando i metodi di consegna virale diventano più adatto 31. Tuttavia, le strategie come l'elettroporazione di plasmidi-CRE esprime in appropriati modelli genetici del mouse possono essere utilizzati per studiare la neurogenesi adulta in tappe di 22.
Due fotoni, confocale standard confocale disco rotante, e largo campo microscopia a fluorescenza possono essere utilizzati per visualizzare neuroblasti migrazione 17,23,24. Spinning con discoLa microscopia focale è un'alternativa più economica alla microscopia a due fotoni. Esso permette l'imaging 3D a velocità superiore attraverso piani multipli z, limitando photobleaching rispetto alla microscopia confocale standard ed offre una risoluzione superiore a quella wide-field imaging di fluorescenza 31-33. La maggior parte dei neuroblasti migrano hanno un soma ben visibile e di un processo di primo piano altamente dinamico punta con un cono di crescita.
Come descritto da altri 17, avente una camera di perfusione consentirebbe di valutare direttamente gli effetti di controllo e trattamenti farmacologici sulla stessa fetta cervello. Mentre consideriamo questo un vantaggio importante, il protocollo qui descritto dimostra che non è assolutamente necessario per la vitalità cellulare per perfusione fette con ossigenato liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) o alta glucosio DMEM 17,33. Inoltre, utilizzando un microscopio invertito consente una più facile manipolazione oggettiva rispetto ai microscopi verticali dotati di obiettivi di immersione in acqua.Abbiamo scoperto che l'utilizzo di un obiettivo 20X-lunga distanza è un ottimo compromesso, consentendo il monitoraggio di un buon numero di cellule (di solito 25-40 per fetta) e produrre immagini di buona risoluzione (Video 1). Inseguimento automatico è anche possibile, tuttavia non è sempre affidabile. Per questo motivo si consiglia visivo e, se necessario, la verifica manuale dei dati di rilevamento automatico. Maggiore ingrandimento di immagini di singoli neuroblasti può essere eseguita utilizzando un obiettivo Nikon Fluor DIC M/N2 40X/0.80W. Il plugin ImageJ liberamente disponibile MTrackJ può anche essere usato per misurare statistiche brano di base 33, tuttavia alcuni file di acquisizione dati grezzi può essere incompatibile con questo software e può avere bisogno di essere convertiti in formati adatti per l'analisi, che in taluni casi può richiedere molto tempo . La combinazione di moduli di acquisizione dell'immagine e analisi fornite dal software Volocity consente un passaggio immediato dalla cattura delle immagini / elaborazione per l'analisi quantitativa dei parametri migratoriotri (velocità, spostamento, ecc), che possono essere facilmente visualizzabili in una varietà di grafici (ad esempio mostrando i modelli migratori / distanza / direzionalità / velocità / persistenza / tempo trascorso immobile, ecc.)
Neuroblasti mostrano un movimento saltatory, alternando migratoria alle fasi stazionarie 34,35 (Figura 3C). Alla luce del fatto che le fasi stazionarie possono essere tra 4-10 min 32, crediamo che l'acquisizione di immagini ogni 3 min rappresenta un buon compromesso per seguire la migrazione dei neuroblasti con illuminazione minima e fotodanneggiamento. Raramente vediamo cellule fermarsi per più di 6 minuti, e scopriamo che, nel corso di un periodo di 3 ore, in genere spendono una media di 30 min immobile. Secondo i rapporti precedenti, neuroblasti hanno una velocità media di 60-100 micron / hr e un indice meandri media (spostamento reale sulla distanza di migrazione), leggermente al di sopra dello 0,6 23,36, che è in accordo con le nostre osservazioni. Typicalleato, circa il 60% delle cellule mostrano un comportamento "migratorio" (ad esempio in seguito percorsi di migrazione quasi lineari, con un indice serpeggiante tra 0,6-1) e il 20-25% sono "sperimentale" (con un indice serpeggiante tra 0-0,4), mentre il restante ~ 20% può essere classificato come "intermedio" (alternando fasi migratorie e sperimentali, con un indice serpeggiante tra 0,4-0,6).
Riconosciamo che ci sono ancora limitazioni a questa tecnica, dato che non possiamo filmare neuroblasts per più di 3-4 ore senza osservare alterazioni sostanziali nella loro motilità. Luoghi durata potrebbe essere aumentata abbassando la frequenza di imaging (tuttavia questo influisce sulla precisione dell'analisi migrazione) e adottando una camera di perfusione per ottimizzare le condizioni ambientali per l'imaging. Tuttavia, il protocollo qui descritto comprendente un periodo di 3-4 ore di imaging rappresenta un compromesso adeguato che permetta la raccolta di dati sufficienti per l'analisi quantitativa deimigrazione. Infatti, finora siamo riusciti a rilevare gli effetti prodotti sulla migrazione da proteine sovraespressione / down-regulation 37 o dalla manipolazione farmacologica dopo il confronto con opportuni controlli (Sonego e Zhou, risultati non pubblicati).
In conclusione, la combinazione di postnatale elettroporazione in vivo con disco rotante imaging culture fetta cervello rappresenta un potente strumento per monitorare le dinamiche di migrazione neuroblasti in un sistema molto simili l'ambiente in vivo, che offre la possibilità di indagare a fondo i meccanismi molecolari che controllano neuroblasti motilità.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
MS e YZ sono supportati da KCL e KCL-Cina borse di dottorato. MO è stato finanziato da una Biotecnologie e Scienze Biologiche Research Council PhD borsa di studio. Ringraziamo Masaru Okabe e Jun-ichi Miyazaki per il plasmide PCX-EGFP e Alain Chedotal e Athena Ypsilanti per preziosi consigli su elettroporazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
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