Identifisere Protein-protein samhandling i<em> Drosophila</em> Voksen Heads av Tandem Affinitetsrensing (TAP)

Summary

Drosophila er kjent for sin kraftige genetisk manipulasjon, men ikke for sin egnethet av detaljert biokjemisk analyse. Her presenterer vi en TAP-basert prosedyre for å identifisere samspill partnere av noe protein av interesse fra fly hjernen. Denne fremgangsmåten kan potensielt føre til nye muligheter for forskning.

Abstract

Genetiske skjermer utført ved hjelp av Drosophila melanogaster (bananflue) har gjort mange milepæl funn i forkant av biologiske vitenskaper. Imidlertid ble bruken av biokjemiske skjermer som tar sikte på å utvide kunnskapen fra genetisk analyse undersøkt først nylig. Her beskriver vi en metode for å rense protein kompleks som forbinder med noe protein av interesse fra voksne fluehoder. Denne metoden tar fordel av Drosophila GAL4/UAS system for å uttrykke et agn protein smeltet sammen med en Tandem Affinitetsrensing (TAP) tag i flue nevroner in vivo, og deretter gjennomfører to runder med rensing ved hjelp av en TAP prosedyre lik den opprinnelig etablert i gjær ¹ for å rense samspill proteinkompleks. Ved slutten av denne prosedyren, er en blanding av flere protein-komplekser erholdt som molekylære identiteter kan bestemmes ved massespektrometri. Validering av kandidatproteiner vil dra nytte av resource og enkelhet i tap-av-funksjon studier i fluer. Lignende tilnærminger kan brukes på andre fly vev. Vi tror at kombinasjonen av genetiske manipulasjoner og dette proteomikk tilnærming i fly modellsystemet har enorm potensial for å håndtere grunnleggende problemer innen nevrobiologi og utover.

Introduction

Definere molekylære stier eller nettverk som formidler en bestemt biologisk prosess er en av de endelige målene for biomedisinsk forskning. Fly genetikere har vært avhengig tungt på termin genetikk, spesielt MODIFIER genetiske skjermer (både Enhancer og suppressor skjermer), for å identifisere faktorer som virker sammen, parallelt med, eller oppstrøms eller nedstrøms av et gen av interesse. Men termin genetikk skjermer ofte ikke klarer å identifisere viktige gener som, når mutert, føre til dødelighet på tidlige utviklingsstadier, eller gener med funksjonell redundans og erstatning som tap av funksjon bare føre til subtile feil som er vanskelig å score. En måte å løse dette problemet er å skjerme for direkte protein-protein interaksjoner. For mer enn et tiår, en voksende liste av biokjemiske metoder, inkludert gjær to-hybrid, fag-skjerm, kjemisk kryssbinding, Co-IP, Tandem Affinitetsrensing (TAP), osv.. er blitt brukt for å undersøke proteiner-protein interaksjoner. Hver av disse metodene har sitt eget sett av styrker og svakheter i forhold til sensitivitet og spesifisitet. Blant dem, tillater TAP metode for deteksjon av fysisk interaksjon i henhold til nær-fysiologiske betingelser, opprettholder spesifisitet og konsistens ² og innbefatter evnen til å strekke seg i high-throughput-analyser ^3,4.

TAP-metoden ble opprinnelig utviklet i gjær ved Rigautand kolleger ^en. I denne metoden, er et protein av interesse uttrykt med et TAP tag. TAP tag havner to uavhengige affinitet-bindende domener: Et protein et domene som binder seg til IgG og en calmodulin-bindende domene. De to domener er atskilt med en TEV (Tobacco Etch Virus) cleavage nettstedet. En slik kombinasjon gir mulighet for to uavhengige runder med affinitet renselser til tilstrekkelig redusere uspesifikke bindinger og berike bestemte bindinger ^en. For dette tilfellet, er det TAP metoden en meget kraftig method å identifisere in vivo interaksjoner av et gitt protein, selv om overekspresjon den eksogene protein kan gjøre det mer utsatt for å assosiere med proteiner som normalt ikke gjør det komplisert med sin endogen motstykke. Siden utviklingen har TAP metoden blitt brukt i mange andre systemer, inkludert celle-kultur-baserte systemer ^5,6 og andre in vivo modellsystemer ^6-9. Her beskriver vi tilpasningen av TAP-metoden i Drosophila. Vi genererer du først pUAST-NTAP og pUAST-CTAP vektorer å lette kloning og fusjon av TAP tag til enten N-eller C-terminal av genet av interesse. Den UAS-TAP-merket transgenet er da uttrykt i nervesystemet under kontroll av en nevronale Gal4 driver ^10. Deretter vil et stort antall voksne fluehoder samles, som har høyt innhold av nerveceller og er lett å skille fra andre deler av kroppen etter frysing basert på størrelsesforskjeller. De voksne hoder er homogenisert og ryddet by sekvensiell sentrifugering, og supernatanten er gitt med TAP fremgangsmåte som er beskrevet nedenfor.

Protocol

En. Generere UAS-TAP-merket Transgene Flies Generere pUAST-TAP-merket DNA-konstruksjoner. Avgjør hvilken side (N-eller C-terminus) av agnet protein TAP-koden må bli smeltet til, på grunnlag av proteinets struktur / funksjons. Se diskusjonen for flere detaljer. Subklon cDNA-kodende område av genet av interesse inn i det multiple kloningssteder (MCS) av pUAST-NTAP eller pUAST-CTAP vektorer for å generere N-eller C-terminal-merkede UAS-TAP-transgener hhv. Se figur 1 for d…

Representative Results

Her viser vi vår innsats i å identifisere Highwire-samspill proteiner i fly hjernen. Highwire (hiw) og dets virveldyr og virvelløse homologer er store ubiquitin ligaser som regulerer utviklingen og reparasjon av nervesystemet 14. De deler en rekke høyt konservert funksjonelle domener. Men deres molekylære handlinger er ikke helt klart. Arbeid utført i ormen, fly og mus førte til den aktuelle arbeidsmodell som HIW fungerer som en E3 ligase og som et stillas protein for å lette dannelse av en multi-sube…

Discussion

Tandem affinitetsrensing (TAP) metoden gir en dobbel rensing protokoll som tillater isolering og anrikning av proteinkomplekser gjennom to uavhengige affinitet rensetrinn. Utformingen av TAP tag er ikke begrenset til det som er presentert i denne protokollen, andre proteinbindingsdomener og motiver er også aktuelt hvis bufferbetingelser er justert tilsvarende. Et godt eksempel på andre TAP koder er GS-TAP tag, en kombinasjon av en G protein og en streptavidin-bindende motiv, designet av Giulio Superti-Furga gruppe ret…

Materials

U.S.A. standard test sieve No. 25	Fisher Scientific	04-881-18
U.S.A. standard test sieve No. 40	Fisher Scientific	04-881-21
Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml	Kimble Chase	885300-0015
IgG sepharose beads	Pharmacia	17-0969-01
Econo-column 0.7 cm x 20 cm	Bio-Rad	737-4721
Econo-column 0.5 cm x 15 cm	Bio-Rad	737-4716
Calmodulin beads	Stratagene	214303
Coors Mortar and Pestle	CoorsTek	60311
AcTEV Protease	Invitrogen	12575-015
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Protease Inhibitor Mix	Sigma	P8340