تحديد البروتين البروتين التفاعل في<em> ذبابة الفاكهة</em> رؤساء الكبار حسب جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات)
Summary
ذبابة الفاكهة تشتهر التلاعب وراثية قوية، ولكن ليس لمدى ملاءمتها من التحليل المتعمق البيوكيميائية. هنا نقدم الداخلي القائم على TAP لتحديد الشركاء التفاعل من أي بروتين من الفائدة من الدماغ الطاير. يمكن لهذا الإجراء أن تؤدي إلى طرق جديدة للبحث.
Abstract
جعلت شاشات الجينية التي أجريت باستخدام ذبابة الفاكهة السوداء البطن (ذبابة الفاكهة) العديد من الاكتشافات بارزة في تقدم العلوم البيولوجية. ومع ذلك، تم استكشاف استخدام شاشات البيوكيميائية التي تهدف إلى توسيع نطاق المعرفة المكتسبة من التحليل الجيني في الآونة الأخيرة فقط. نحن هنا تصف طريقة لتنقية معقدة البروتين الذي الزميلة مع أي بروتين من الفائدة من رؤساء ذبابة الكبار. هذا الأسلوب يستفيد من نظام ذبابة الفاكهة GAL4/UAS للتعبير عن البروتين الطعم تنصهر مع علامة جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات) في الخلايا العصبية ذبابة في الجسم الحي، ومن ثم تطبق جولتين من تنقية باستخدام إجراء TAP مماثلة لتلك التي أنشئت أصلا في الخميرة 1 لتنقية معقدة البروتين التفاعل. في نهاية هذا الإجراء، يتم الحصول على خليط من البروتين المجمعات متعددة الذي يمكن تحديده من خلال مطياف الكتلة الهويات الجزيئية. سوف المصادقة على البروتينات مرشح الاستفادة من صesource وسهولة أداء الخسارة من وظيفة الدراسات في الذباب. نهج مماثلة يمكن تطبيقها على الأنسجة ذبابة أخرى. ونحن نعتقد أن الجمع بين التلاعب الجيني وهذا النهج البروتين في النظام النموذجي ذبابة يحمل إمكانات هائلة لمعالجة المشاكل الأساسية في مجال بيولوجيا الأعصاب وخارجها.
Introduction
تحديد المسارات الجزيئية أو الشبكات التي تتوسط عملية بيولوجية معينة هي واحدة من الأهداف النهائية للبحوث الطبية الحيوية. يطير علماء الوراثة قد تعتمد اعتمادا كبيرا على الوراثة إلى الأمام، وخاصة معدل شاشات الجينية (سواء محسن وشاشات القامع)، لتحديد العوامل التي تعمل معا، بالتوازي مع، أو المنبع أو المصب من الجينات في المصالح. ومع ذلك، وشاشات الوراثة إلى الأمام في كثير من الأحيان تفشل مرات لتحديد الجينات الأساسية التي، عندما تحور، يسبب الفتك في مراحل النمو المبكرة، أو الجينات مع التكرار وظيفية والتعويض الذي يسبب فقدان وظيفة العيوب الخفية التي هي سكنت الشباك فقط. طريقة واحدة للتغلب على هذه الصعوبة هو للكشف عن مباشرة تفاعلات البروتين البروتين. لأكثر من عقد من الزمن، قائمة متزايدة من أساليب الكيمياء الحيوية، بما في ذلك الخميرة اثنين الهجين، وعرض فج والكيميائية عبر ربط، المشارك IP، جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات)، الخ. وقد استخدمت للتحقيق في البروتينتفاعلات البروتين. كل من هذه الأساليب لديها مجموعة من نقاط القوة والضعف في ما يخص الحساسية والنوعية. فيما بينها، ويسمح أسلوب TAP للكشف عن التفاعل المادي في ظل ظروف شبه الفسيولوجية، ويحافظ على خصوصية والاتساق 2 ويشمل القدرة على تمتد إلى الإنتاجية العالية يحلل 3،4.
طريقة TAP وضعت أصلا من قبل الزملاء في الخميرة Rigautand 1. في هذه الطريقة، يتم التعبير عن بروتين في المصالح مع علامة TAP. علامة TAP تؤوي اثنين من المستقلين ملزم تقارب المجالات: بروتين A المجال الذي يربط مفتش ومجال كالمودولين ملزم. يتم فصل اثنين من المجالات من قبل TEV (التبغ إحفر الفيروسات) موقع الانقسام. مثل هذا الجمع يسمح للجولتين مستقلة عن التنقيات تقارب بما فيه الكفاية للحد من الارتباطات غير محددة وإثراء الارتباطات محددة 1. لهذا المثال، الأسلوب TAP هو metho قوية جداد لتحديد التفاعلات في الجسم الحي من بروتين معين، على الرغم من overexpressing البروتين الخارجية قد جعلها أكثر عرضة للربط مع البروتينات التي تفعل عادة يست معقدة مع نظيرتها المحلية. منذ تطورها، وقد تم تطبيق الأسلوب TAP في العديد من الأنظمة الأخرى، بما في ذلك المستندة إلى خلية ثقافة النظم 5،6 وغيرها من النظم في الجسم الحي نموذج 6-9. نحن هنا وصف التكيف للأسلوب TAP في ذبابة الفاكهة. علينا أولا توليد pUAST-NTAP وpUAST-CTAP ناقلات لتسهيل الاستنساخ والانصهار للعلامة TAP إما إلى N-أو C-محطة من الجينات في المصالح. ثم يتم أعرب الموسومة TAP UAS التحوير في الجهاز العصبي تحت سيطرة السائق GAL4 العصبية 10. المقبل، وسيتم جمع عدد كبير من رؤساء ذبابة الكبار، التي لديها نسبة عالية من الخلايا العصبية وسهلة لفصل من أجزاء أخرى من الجسم بعد تجميد بناء على حجم الخلافات. رؤساء الكبار هي المتجانس وتطهيرها بcentrifugations متتابعة ذ، وطاف يخضع لإجراء TAP هو موضح أدناه.
Protocol
Representative Results
Discussion
يقدم طريقة تنقية تقارب جنبا إلى جنب (وات) بروتوكول تنقية المزدوجة التي تسمح للعزلة وإثراء المجمعات البروتين من خلال خطوتين مستقلة تنقية تقارب. ولا يقتصر تصميم علامة TAP إلى ما يرد في هذا البروتوكول، والمجالات الأخرى ملزمة البروتين والزخارف تنطبق أيضا إذا تم تعديل شرو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر EUROSARF لإرسال لنا الخميرة TAP البلازميدات التعبير. ونحن ممتنون أيضا للحصول على مساعدة من التحرير ريان Labadens. وأيد هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة / NINDS (R01NS070962) لCW
Materials
| U.S.A. standard test sieve No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| U.S.A. standard test sieve No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| IgG sepharose beads | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| Calmodulin beads | Stratagene | 214303 | |
| Coors Mortar and Pestle | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protease Inhibitor Mix | Sigma | P8340 |
References
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).
- Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Forler, D., et al. An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes. Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Li, Y. The tandem affinity purification technology: an overview. Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).
- Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry. Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).
- Xu, X., et al. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bachmann, A., Knust, E. The use of P-element transposons to generate transgenic flies. Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Candiano, G., et al. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Tian, X., Wu, C. The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm. J. Physiol. , (2013).
- Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements. J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).
- Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth. Neural Dev. 2, 16 (2007).
- Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons. Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).
- Burckstummer, T., et al. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system. Fly. 2, 229-235 (2008).
- Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), e3643 (2012).
- Wu, Y., et al. A Drosophila model for Angelman syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).
- Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. Shotgun proteomics in neuroscience. Neuron. 63, 12-26 (2009).
