La identificación de la interacción proteína-proteína en<em> Drosophila</em> Jefes adultas por Tandem Affinity purificación (TAP)

Summary

Drosophila es famoso por su gran alcance de la manipulación genética, pero no por su idoneidad del análisis bioquímico en profundidad. Aquí presentamos un procedimiento basado en TAP para identificar socios que interactúan de cualquier proteína de interés a partir de cerebro de la mosca. Este procedimiento puede potencialmente conducir a nuevas vías de investigación.

Abstract

Pantallas genéticos realizados con Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) han hecho numerosos descubrimientos hito en el avance de las ciencias biológicas. Sin embargo, el uso de pantallas bioquímicos destinados a ampliar los conocimientos adquiridos en el análisis genético fue explorado recientemente. Aquí se describe un método para purificar el complejo de la proteína que se asocia con cualquier proteína de interés a partir de cabezas de moscas adultas. Este método toma ventaja del sistema de Drosophila GAL4/UAS para expresar una proteína cebo fusionado con una etiqueta tándem Purificación por Afinidad (TAP) en las neuronas de la mosca in vivo, y luego implementa dos rondas de purificación utilizando un procedimiento de punción similar a la establecida originalmente en de levadura ¹ para purificar el complejo de proteína de interacción. Al final de este procedimiento, se obtiene una mezcla de varios complejos de proteínas cuyas identidades molecular se puede determinar por espectrometría de masas. Validación de las proteínas candidatas se beneficiará de la resource y la facilidad de la realización de estudios de pérdida de función en las moscas. Enfoques similares se pueden aplicar a otros tejidos de la mosca. Creemos que la combinación de la manipulación genética y este enfoque proteómico en el sistema modelo de la mosca tiene un tremendo potencial para abordar los problemas fundamentales en el campo de la neurobiología y más allá.

Introduction

Definición de las vías moleculares o redes que median un proceso biológico en particular es uno de los objetivos fundamentales de la investigación biomédica. Fly genetistas han dependido en gran medida de la genética a plazo, especialmente modificador pantallas genéticos (tanto potenciadoras y pantallas supresoras), para identificar los factores que trabajan juntos, en paralelo con, o aguas arriba o aguas abajo de un gen de interés. Sin embargo, las pantallas de genética hacia adelante muchas veces fallan en identificar los genes esenciales que, cuando muta, causa la letalidad en las etapas tempranas del desarrollo, o los genes con redundancia funcional y una indemnización, cuya pérdida de la función única causa defectos sutiles que son difíciles de marcar. Una forma de superar esta dificultad es la detección de interacciones directas proteína-proteína. Durante más de una década, una creciente lista de métodos bioquímicos, incluyendo la levadura de dos híbridos, visualización de fagos, entrecruzamiento químico, Co-IP, Tandem Affinity purificación (TAP), etc. se han utilizado para investigar proteínas-proteína interacciones. Cada uno de estos enfoques tiene su propio conjunto de fortalezas y debilidades en cuanto a sensibilidad y especificidad. Entre ellos, el método de TAP permite la detección de la interacción física bajo condiciones casi fisiológicas, conserva la especificidad y la consistencia y ² incluye la capacidad de extender al análisis de alto rendimiento de ^3,4.

El método TAP fue desarrollado originalmente en levadura por colegas Rigautand ^1. En este método, una proteína de interés se expresa con una etiqueta de TAP. La etiqueta TAP alberga dos dominios de unión por afinidad independientes: una proteína de un dominio que se une a IgG y un dominio de unión a calmodulina. Los dos dominios están separados por una TEV (Tobacco Etch Virus) sitio de escisión. Tal combinación permite dos rondas independientes de purificaciones de afinidad para reducir suficientemente enlaces no específicos y enriquecen enlaces específicos ^1. Para este ejemplo, el método TAP es una muy poderosa method para identificar en las interacciones in vivo de una proteína dada, aunque la sobreexpresión de la proteína exógena puede hacer que sea más propensos a asociarse con proteínas que normalmente no complejo con su homólogo endógeno. Desde su desarrollo, el método TAP se ha aplicado en muchos otros sistemas, incluidos los sistemas celulares basados ​​en la cultura y otros ^5,6 sistemas modelo in vivo en ^6-9. Aquí se describe la adaptación del método TAP en Drosophila. En primer lugar, generar vectores pUAST-NTAP y pUAST-CTAP para facilitar la clonación y la fusión de la etiqueta TAP para el extremo N-o C-terminal del gen de interés. El TAP-etiquetados-UAS transgén se expresa entonces en el sistema nervioso bajo el control de un controlador de GAL4 neuronal ^10. A continuación, se recogerá un gran número de cabezas de moscas adultas, que tienen un alto contenido de células neuronales y son fáciles de separar de otras partes del cuerpo después de la congelación sobre la base de las diferencias de tamaño. Las cabezas de los adultos se homogeneizan y se aclaró bcentrifugaciones secuenciales y, y el sobrenadante está sujeto a un procedimiento de punción se describe a continuación.

Protocol

1. Generar UAS-TAP-etiquetados moscas transgénicas Generar pUAST-TAP-etiquetados construcciones de ADN. Decidir qué lado (N-o C-terminal) de la proteína cebo la etiqueta grifo deberá estar fusionada a, basada en la estructura / función de la proteína. Véase la discusión para más detalles. Subclónese la región de codificación de cDNA del gen de interés en los sitios de clonación múltiple (MCS) de los vectores pUAST-NTAP o pUAST-CTAP para generar N-o C-terminal de etiquetado tr…

Representative Results

Aquí se demuestra nuestro esfuerzo en la identificación de proteínas Highwire interaccionan en el cerebro de mosca. Highwire (Hiw) y sus homólogos de vertebrados e invertebrados son enormes ubiquitina ligasas que regulan el desarrollo y la reparación del sistema nervioso 14. Ellos comparten una serie de dominios funcionales altamente conservadas. Sin embargo, sus acciones moleculares no están del todo claras. El trabajo realizado en gusano, mosca y el ratón condujo al modelo de trabajo actual que HIW f…

Discussion

Método de purificación por afinidad en tándem (PAT) ofrece un protocolo de purificación dual que permite el aislamiento y enriquecimiento de complejos de proteínas a través de dos etapas de purificación de afinidad independientes. El diseño de la etiqueta TAP no se limita a lo que se presenta en este protocolo, otros dominios y motivos de unión de proteínas también son aplicables si las condiciones del tampón se ajustan en consecuencia. Un buen ejemplo de otras etiquetas de TAP es la etiqueta GS-TAP, una com…

Materials

U.S.A. standard test sieve No. 25	Fisher Scientific	04-881-18
U.S.A. standard test sieve No. 40	Fisher Scientific	04-881-21
Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml	Kimble Chase	885300-0015
IgG sepharose beads	Pharmacia	17-0969-01
Econo-column 0.7 cm x 20 cm	Bio-Rad	737-4721
Econo-column 0.5 cm x 15 cm	Bio-Rad	737-4716
Calmodulin beads	Stratagene	214303
Coors Mortar and Pestle	CoorsTek	60311
AcTEV Protease	Invitrogen	12575-015
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Protease Inhibitor Mix	Sigma	P8340