Protein-protein etkileşimi belirlenmesi<em> Drosophila</emTandem Affinity Arıtma tarafından> Adult Başlar (TAP)
Summary
Drosophila ama derinlemesine biyokimyasal analiz uygunluğu için, güçlü genetik manipülasyon ünlüdür. Burada sinek beyin ilgi herhangi bir proteinin etkileşim ortakları belirlemek için TAP-tabanlı bir prosedür mevcut. Bu prosedür, potansiyel araştırma yeni yollar yol açabilir.
Abstract
Drosophila melanogaster (meyve sineği) kullanılarak yapılan genetik ekranlar biyolojik bilimler önceden sayısız kilometre taşı keşifler yaptık. Ancak genetik analiz edinilen bilgiye genişletmeyi amaçlayan biyokimyasal ekranlarının kullanımı sadece son zamanlarda araştırılmıştır. Burada protein kompleksi arındırmak için bir yöntem tarif erişkin sinek başkanlarının ilgi herhangi bir protein ile ilişkilendirir. Bu yöntem, in vivo nöron uçucu bir Tandem Affinity saflaştırma (TAP) etiketi ile ikame edilmiş bir yem proteini ifade etmek için Drosophila GAL4/UAS sistemi yararlanır ve daha sonra ilk kurulan benzer bir prosedür kullanılarak TAP arıtma iki tur uygular etkileşimli protein kompleksinin saflaştırılması için maya 1. Bu işlemin sonunda, çok sayıda protein kompleksleri oluşan bir karışım olan bir moleküler kimlikleri kütle spektrometresi ile belirlenebilir elde edilir. Aday proteinlerin Doğrulama r yararlanacakesource ve sinekler kaybı fonksiyon-çalışmaları gerçekleştirme kolaylığı. Benzer yaklaşımlar, diğer uçucu dokulara uygulanabilir. Biz sinek model sistemde genetik manipülasyonlar ve bu proteomik yaklaşımın birleşimi nörobiyoloji alanında ve ötesinde temel sorunlarla mücadele için muazzam bir potansiyele sahip olduğuna inanıyoruz.
Introduction
Belirli bir biyolojik süreç aracılık moleküler yollar veya ağları tanımlama biyomedikal araştırmanın nihai hedeflerinden biridir. Fly genetikçiler, özellikle paralel olarak, birlikte çalışmak, ya yukarı ya da ilgi bir genin aşağı faktörleri tespit etmek, genetik ekranlar (arttırıcı ve baskılayıcı ekranlar) niteleyici, ileri genetik temeline bağlıydı var. Ancak, ileriye genetik ekranlar çoğu kez mutasyona uğradığı zaman, kimin fonksiyon kaybı sadece puan zor ince kusurlarına neden fonksiyonel fazlalık ve tazminat ile erken gelişim aşamalarında öldürücülüğü, ya da genlerin neden olan, gerekli genleri tanımlamak için başarısız. Bu zorluğun üstesinden gelmek için bir yolu direkt protein-protein etkileşimleri için taranmasıdır. Daha fazla on yıl için, vb maya iki-hibrid, faj gösterimi, kimyasal olarak çapraz bağlanma, Co-IP, Tandem Affinity saflaştırılması (TAP), dahil olmak üzere, biyokimyasal yöntemler, giderek artan bir listesi. proteini incelemek için kullanılmıştır-Protein etkileşimleri. Bu yaklaşımların her biri güçlü ve duyarlılık ve özgüllük açısından zayıflıkları kendi belirledi. Bunlar arasında, TAP yöntem olup, yakın fizyolojik koşullar altında fiziksel etkileşimi tespiti sağlar özgüllük ve tutarlılık 2 koruyan ve 3,4 analiz, yüksek verim için genişletmek için de içerir.
TAP yöntem aslında Rigautand arkadaşları 1 tarafından maya geliştirilmiştir. Bu yöntemde, ilgi konusu bir protein, TAP etiketi ile ifade edilir. Bir Protein IgG bağlanan bir etki ve Kalmadulin bağlanma alanı: TAP etiketi iki bağımsız afinite bağlanma alanlarını barındırır. Bu iki etki, bir TEV (Tütün Etch Virüsü) yarılma sitesi ile ayrılır. Afinite arındırmalardan bağımsız iki mermi yeterince spesifik olmayan bağlamaları azaltmak ve belirli bağlamaları 1 zenginleştirmek için böyle bir kombinasyon sağlar. Bu örnek için, TAP yöntem çok güçlü bir metoksidışsal proteini aşırı ifade, normal olarak endojen muadili ile kompleks yapma proteinler ile ilişkilendirmek için daha eğilimli hale getirebilir, ancak, belirli bir proteinin in vivo etkileşim içinde tespit d. Gelişimi bu yana, TAP yöntem, hücre-kültür temelli sistemler 5,6 ve in vivo model sistemlerinde 6-9 de dahil olmak üzere pek çok diğer sistemler de uygulanmıştır. Burada Drosophila TAP yöntemin adaptasyonu açıklar. İlk olarak, ilgi konusu genin N-veya C-terminali ya da üzere TAP etiketinin klonlama ve birleşmeyi kolaylaştırmak için pUAST-NTAP ve pUAST-CTAP vektörleri üretir. UAS-TAP-etiketli transgen daha sonra bir nöronal GAL4 sürücü 10 kontrolünde sinir sisteminde ifade edilir. Daha sonra, yetişkin sinek kafaları çok sayıda nöral hücre içeriği yüksek olan ve büyüklüğü farklılıklara göre dondurucu sonra diğer vücut parçaları ayırmak kolay olan, toplanacaktır. Yetişkin kafaları homojenize ve temizlenir b vardıry ardışık santrüfüj ve süpernatan, aşağıda tarif edilen bir prosedüre TAP tabidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tandem afinite saflaştırma (TAP) yöntemi, iki bağımsız afinite saflaştırma adımları üzerinden izole edilmesini ve protein kompleksleri zenginleştirme sağlayan bir çift saflaştırma protokolü bulunmaktadır. TAP etiketinin tasarımı bu protokolde yer ne sınırlı değildir tampon şartları buna göre ayarlanır ise, başka bir protein bağlayıcı etki ve motifleri de geçerlidir. Diğer TAP etiketlerin iyi bir örnek GS-TAP etiketi, bir G-proteinine ait bir arada ve kültürlenmiş memeli hücre çizg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bize maya TAP plasmidlerini göndermek için EUROSARF teşekkür ederim. Biz de Ryan Labadens gelen editoryal yardım için minnettarız. Bu çalışma CW bir NIH / NINDS hibe (R01NS070962) tarafından desteklenen
Materials
| U.S.A. standard test sieve No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| U.S.A. standard test sieve No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| IgG sepharose beads | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| Calmodulin beads | Stratagene | 214303 | |
| Coors Mortar and Pestle | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protease Inhibitor Mix | Sigma | P8340 |
References
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).
- Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Forler, D., et al. An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes. Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Li, Y. The tandem affinity purification technology: an overview. Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).
- Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry. Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).
- Xu, X., et al. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bachmann, A., Knust, E. The use of P-element transposons to generate transgenic flies. Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Candiano, G., et al. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Tian, X., Wu, C. The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm. J. Physiol. , (2013).
- Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements. J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).
- Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth. Neural Dev. 2, 16 (2007).
- Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons. Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).
- Burckstummer, T., et al. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system. Fly. 2, 229-235 (2008).
- Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), e3643 (2012).
- Wu, Y., et al. A Drosophila model for Angelman syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).
- Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. Shotgun proteomics in neuroscience. Neuron. 63, 12-26 (2009).
