اكتشاف جديد بين الخلايا مسببات الأمراض عن طريق Amoebal Coculture والمناهج Amoebal التخصيب
Summary
coculture Amoebal هو نظام زراعة الخلايا باستخدام الأميبات تمسكا تنمو بشكل انتقائي مسببات الأمراض داخل الخلايا قادرة على مقاومة الخلايا البلعمية مثل الأميبات والضامة. وبالتالي فإنه يمثل أداة رئيسية لاكتشاف العوامل المعدية الجديدة. تخصيب Amoebal يسمح اكتشاف الأنواع الجديدة وamoebal من البكتيريا داخل الخلايا الخاصة.
Abstract
مسببات الأمراض مثل البكتيريا داخل الخلايا، المتفطرات والكائنات الحية مثل الكلاميديا يصعب عزل لأنهم غالبا ما تنمو بشكل سيئ أو لا على الاطلاق على وسائل الإعلام الانتقائي الذي عادة ما تستخدم لزراعة البكتيريا. لهذا السبب، تم اكتشاف العديد من هذه الجراثيم إلا في الآونة الأخيرة أو في أعقاب تفشي الهامة. غالبا ما ترتبط هذه الجراثيم مع الأميبات، والتي تكون بمثابة خلايا المضيف والسماح للبقاء ونمو البكتيريا. نعتزم هنا لتقديم مظاهرة من اثنين من التقنيات التي تسمح العزلة وتوصيف مسببات الأمراض داخل الخلايا الموجودة في العينات السريرية أو البيئية: وcoculture amoebal وتخصيب amoebal. coculture Amoebal يسمح الانتعاش من البكتيريا داخل الخلايا، فحقن العينة على التحقيق في الحديقة amoebal التي يمكن أن تكون مصابة و lysed من البكتيريا داخل الخلايا الموجودة في العينة. يسمح تخصيب Amoebal استرداد الأميبات موجودة في عينة سريرية أو البيئية. الويمكن أن يؤدي إلى اكتشاف أنواع جديدة amoebal ولكن أيضا من البكتيريا داخل الخلايا الجديدة المتنامية على وجه التحديد في هذه الأميبات. معا، وهذه التقنيات اثنين تساعد على اكتشاف البكتيريا داخل الخلايا الجديدة قادرة على النمو في الأميبات. نظرا لقدرتها على إصابة الأميبات ومقاومة البلعمة، قد هذه البكتيريا داخل الخلايا أيضا الهروب البلعمة التي الضامة، وبالتالي، تكون الممرضة لحقيقيات النوى أعلى.
Introduction
قبل ظهور التشخيص الجزيئي، والكائنات الدقيقة الموجودة في محاريب البيئية أو في العينات السريرية في كثير من الأحيان الكشف عنها من قبل زراعتها على وسائل الإعلام الانتقائي مختلفة، وذلك أساسا على أجار في أطباق بتري. النمط الظاهري من المستعمرات البكتيرية ونشاطهم الأيضية ثم سمح تصنيف البكتيريا على مستوى الأنواع. ويمكن أيضا أن تستخدم مرق لزيادة حساسية الكشف. ومع ذلك، كل التقنيات لا تسمح الانتعاش من البكتيريا التي تنمو ببطء أو لا على الاطلاق على هذه الوسائط. هذا هو السبب وتستخدم على نطاق واسع النهج الجزيئية في الوقت الحاضر. ومع ذلك، والكشف عن الحمض النووي لا يقدم أي دليل على بقاء البكتيريا. علاوة على ذلك، على العكس من الثقافة، والنهج الجزيئية لا يؤدي إلى سلالة يمكن أن تكون كذلك تتميز.
دراسة مسببات الأمراض التي تنمو بشكل سيئ على وسائل الاعلام الصلبة أو أن الخلايا تنمو الحاجة إلى معقد. معظم هذه "من الصعب أن تنمو البكتيريا" هي INTR الحساسيةالبكتيريا ديكي، وكثيرا ما اكتشف وتتميز التالية تفشي كبيرة كما كان الحال بالنسبة لالمستروحة البكتيريا. وقد تميزت هذه البكتيريا التالية تفشى التي وقعت خلال اتفاقية الفيلق الاميركي. أصيب ما لا يقل عن 182 شخصا وتوفي 29 بسبب التهاب رئوي حاد 1،2. وقد تجلى لاحقا أن الأميبات كانت الحاضن الطبيعي لهذه البكتيريا والتي كان وجودها في شبكات الفنادق نظام تكييف الهواء والماء في أصل اندلاع مرض ما يسمى الجندي 3.
الأميبات موجودة في جميع أنحاء العالم وكانت معزولة من التربة والهواء والماء والغشاء المخاطي للأنف من متطوعين من البشر (مراجعة في 4). هذه الأميبات "حرة المعيشة" يتم تقسيم عموما بشكل مستقل في البيئة ولكن في بعض الأحيان قد تغزو المضيفين متساهلة 5. تغذية الأميبات على مختلف الكائنات الدقيقة من خلال البلعمة واللاحقة الليزوزومية الهضم بواسطة HYdrolases 6. العديد من أنواع البكتيريا داخل الخلايا الاختيارية أو تلزم هي قادرة على مقاومة عملية الهضم، وبالتالي تصيب وتقسيم في الأميبات على سبيل المثال البكتيريا أو المتفطرات المرتبطة الكلاميديا البكتيريا، (مراجعة في 7 و 8). الأميبات حرة المعيشة المرجح تمثل الخزان المحتملة الهامة للبكتيريا داخل الخلايا التي تم اكتشافها حتى الآن لا. قاد هذه المجموعة جهدنا لتنفيذها في لوزان اثنين من التقنيات الرئيسية، ودعا coculture amoebal وتخصيب amoebal، مما سمح مجموعات مختلفة لعزل الكائنات الدقيقة العديد من الخلايا تلزم جديدة من العينات البيئية المختلفة 9-15.
منذ الأميبات هي البالعات المهنية الرعي على البكتيريا، قد بكتيريا قادرة على مقاومة البلعمة وتنمو داخل هذه الأولانيات أيضا استعمار البالعات الإنسان وتكون الممرضة تجاه البشر. وقد تجلى هذا بشكل جزئي لبعض أنواع البكتيريا المرتبطة الكلاميديا، مثل Waddlia تشوndrophila. دبليو chondrophila يمكن أن تنمو، ليس فقط في الأميبات ولكن أيضا في العديد من أنواع الخلايا مثل الخلايا الظهارية الثديية، الضامة، وخطوط الخلايا الأسماك 16-18. يظهر coculture amoebal أيضا ذات الصلة للكشف عن البكتيريا داخل الخلايا في العينات السريرية 19،20، بما في ذلك البراز التي تكون ملوثة بشكل كبير مع الأنواع البكتيرية المختلفة 21.
نحن هنا وصف الخطوات الرئيسية لcoculture amoebal وتخصيب amoebal، بما في ذلك (أ) معاملة العينات البيئية أو السريرية، (ب) نمو الأميبات على وسائل الإعلام وممحوضة على العشب البكتيريا القولونية و (ج) اختيار وتوصيف من البكتيريا داخل الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
coculture Amoebal وتخصيب amoebal طرق فعالة التي سمحت للعزل العديد من الأنواع البكتيرية وamoebal جديدة. النتائج التي تم الحصول عليها مع هذه الأساليب تؤكد وجود في كل مكان من كلا الأميبات والبكتيريا مقاومة الأميبا في البيئة، وهذا هو الأكثر أهمية في شبكات المياه من صنع الإنسان التي تع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر العلاقات العامة. برنار لا سكولا للحصول على النصائح التقنية مفيدة ومناقشة مثيرة للاهتمام على coculture amoebal وتخصيب amoebal. نشكر أيضا الدكتور فنسنت توماس لمساعدته في تنفيذ هذه التقنية في مختبرنا.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 108342 | |
| 0.22 μm pore size membrane | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCVPU11RE | |
| proteose peptone | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 211693 | |
| yeast extract | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 212750 | |
| Cell culture flasks | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 353135 | |
| Kova slide | Hycor, Indianapolis, IN | 87144 | |
| cell culture microplates | Corning Inc, Corning, NY | 3524 | |
| Diff-Quik staining kit | Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany | 130832 | |
| Ziehl fuchsin | Fluka, St-Louis, MI | 21820 | |
| basic fuchsin | Sigma, St-Louis, MI | 857843 | |
| Phenol | Sigma, St-Louis, MI | P1037 | Corrosive and mutagenic |
| malachite green oxalate | Fluka, St-Louis, MI | 63160 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15710 | |
| Saponin | Sigma, St-Louis, MI | 84510 |
References
- Fraser, D. W., et al. Legionnaires’ disease: description of an epidemic of pneumonia. New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
- McDade, J. E., et al. Legionnaires’ disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).
- Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
- Rodriguez-Zaragoza, S. Ecology of free-living amoebae. Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).
- Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).
- Brussow, H. Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).
- Greub, G., Raoult, D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).
- Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).
- Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae. Lancet. 349, 925-926 (1997).
- Amann, R., et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).
- Birtles, R. J., et al. Candidatus Odyssella thessalonicensis’ gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).
- Thomas, V., Casson, N., Greub, G. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).
- Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).
- Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).
- Corsaro, D., et al. Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant. Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).
- Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages. Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).
- Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila. Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).
- Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).
- Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia. FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).
- Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures. Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).
- Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).
- Isenberg, H. D. . Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).
- Gimenez, D. F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 39, 135-140 (1964).
- Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).
- Miyamoto, H., et al. Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).
- Lienard, J., et al. Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples. J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).
- Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan. Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).
- Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants. Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).
- La Scola, B., et al. Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).
- Thomas, V., Casson, N., Greub, G. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).
- La Scola, B., et al. Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).
- Collingro, A., et al. Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp. Microbiology. 151, 301-309 (2005).
- Lienard, J., Croxatto, A., Prod’hom, G., Greub, G. Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order. Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).
- La Scola, B., et al. A giant virus in amoebae. Science. 299, 2033 (2003).
- Boyer, M., et al. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).
- Thomas, V., et al. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).
- Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. Laboratory infection of a technician by mimivirus. Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).
- Greub, G. Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).
- Lamoth, F., Greub, G. Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia. FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).
- Lienard, J. G., Ashbolt, K., Sen, N. J. Ch. 6. Environmental microbiology, current technology and water applications. , 143-162 (2011).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ. Microbiol. , (2012).
- Ovrutsky, A. R., et al. Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).
