Summary

Descoberta de Novos intracelulares Patógenos por amebas Coculture e Abordagens de amebas de enriquecimento

Published: October 27, 2013
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Summary

Cocultura amebas é um sistema de cultura de células usando as amebas aderente para crescer selectivamente patogénios intracelulares capazes de resistir as células fagocíticas, tais como amebas e macrófagos. Representa, portanto, uma ferramenta-chave para descobrir novos agentes infecciosos. Enriquecimento amebas permite a descoberta de novas espécies de amebas e das suas bactérias intracelulares específicos.

Abstract

Patógenos intracelulares como legionella, micobactérias e organismos Chlamydia-como são difíceis de isolar, porque eles geralmente crescem pouco ou nada em meios seletivos que são normalmente utilizados para cultivar bactérias. Por esta razão, muitos destes patógenos foram descobertos apenas recentemente, ou na sequência de surtos importantes. Estes patógenos são frequentemente associados com amebas, que servem como-célula hospedeira e permitir a sobrevivência eo crescimento das bactérias. Pretendemos aqui para dar uma demonstração de duas técnicas que permitem o isolamento e caracterização de patógenos intracelulares presentes em amostras clínicas e ambientais: a co-cultura amebas eo enriquecimento amebas. Cocultura amebas permite a recuperação de bactérias intracelulares, inoculando a amostra investigada para um relvado amebas que podem ser infectadas e lisadas por bactérias intracelulares presentes na amostra. Enriquecimento amebas permite a recuperação de amebas presente numa amostra clínica ou ambiental. ThÉ possível levar à descoberta de novas espécies de amebas, mas também de novas bactérias intracelulares crescem especificamente nestas amebas. Juntas, essas duas técnicas ajudam a descobrir novas bactérias intracelulares capazes de crescer em amebas. Devido à sua capacidade para infectar as amebas e resistir a fagocitose, estas bactérias intracelulares também pode escapar a fagocitose pelos macrófagos e, assim, ser patogénico para eucariotas superiores.

Introduction

Antes do advento de diagnóstico molecular, os microrganismos presentes em nichos ambientais ou em amostras clínicas foram frequentemente detectado cultivando-os em diferentes meios selectivos, principalmente em agar em pratos de Petri. O fenótipo das colónias de bactérias e a sua actividade metabólica depois deixada classificação bacteriana ao nível da espécie. Caldo também pode ser usado para aumentar a sensibilidade de detecção. No entanto, ambas as técnicas não permitem a recuperação de bactérias que crescem lentamente ou não em todos nestes meios. Esta é a razão pela qual abordagens moleculares são tão amplamente utilizados hoje em dia. No entanto, a detecção de ADN não fornece nenhuma pista sobre a viabilidade das bactérias. Além disso, ao contrário da cultura, as abordagens moleculares não resultar numa estirpe que pode ser ainda caracterizada.

Estudar patógenos que crescem pouco em meios sólidos ou que as células precisam para crescer é complicado. A maioria destes "difícil crescer" bactérias são intr exigenteacelular bactérias, muitas vezes descoberto e caracterizado seguinte grandes surtos como era o caso de Legionella pneumophila. Esta bactéria foi marcado após um surto que ocorreu durante uma convenção da Legião Americana. Tal como muitos como 182 pessoas foram infectadas e 29 morreram devido a uma pneumonia grave 1,2. Mais tarde, foi demonstrado que as amebas foram os anfitriões naturais desta bactéria e que a sua presença nas redes de hotel do sistema de ar-condicionado e água esteve na origem do surto da doença a chamada do Legionário 3.

Amebas estão presentes em todo o mundo e foram isolados do solo, do ar, da água e da mucosa nasal de voluntários humanos (revisada em 4). Essas amebas "vida livre" são geralmente dividindo de forma autônoma no ambiente, mas ocasionalmente pode invadir hospedeiros permissivos 5. Alimentação Amebas em vários microorganismos através de fagocitose e digestão lisossômico subseqüente por hydrolases 6. Muitas bactérias intracelulares facultativos ou obrigatórios são capazes de resistir a digestão e, assim, infectar e se dividir em amebas como por exemplo bactérias ou micobactérias relacionadas com Chlamydia Legionella, (revisto em 7 e 8). Amebas de vida livre provavelmente representam um importante reservatório potencial de bactérias intracelulares que ainda não foram descobertos. Isso levou nosso grupo a implementar em Lausanne duas técnicas principais, chamados de co-cultura amebas e enriquecimento amebas, o que permitiu diferentes grupos para isolar vários novos microrganismos intracelulares obrigatórios a partir de várias amostras ambientais 9-15.

Desde amebas são fagócitos profissionais que pastam em bactérias, uma bactéria capaz de resistir a fagocitose e crescer dentro destes protistas também pode colonizar fagócitos humanos e ser patogênico para seres humanos. Este efeito foi parcialmente demonstrada para algumas bactérias relacionadas com a Chlamydia, como Waddlia chondrophila. W. chondrophila pode crescer não apenas em amebas, mas também em vários tipos de células, tais como células de mamíferos epiteliais, macrófagos, e linhas celulares de peixe 16-18. A co-cultura amebas também parece relevante para a detecção de bactérias intracelulares em amostras clínicas 19,20, incluindo fezes que são fortemente contaminados com diferentes espécies de bactérias 21.

Aqui nós descrevemos as principais etapas de co-cultura amebas e enriquecimento amebas, incluindo (a) tratamento de amostras ambientais e clínicas, (b) o crescimento de amebas em mídia axênicas e em um gramado bacteriano de Escherichia coli e (c) a seleção e caracterização de bactérias intracelulares.

Protocol

1. Amebas Coculture 1.1 Preparação da amostra Amostra ambiental As amostras de água Filtra-se a amostra de água (500 ml a 1 litro), por meio de uma membrana de 0,22 de tamanho de poro. Em seguida, agitar a membrana nos ameba salinas PAS médias de página (120 mg de NaCl, 4 mg de MgSO4 • 7H 2 O, 4 mg de CaCl 2 • 2H 2 O, 142 mg de Na 2 HPO 4, e 136 mg de KH …

Representative Results

Utilizando co-cultura amebas e enriquecimento amebas, toda uma gama de bactérias do ambiente e / ou patogénicos foram descobertos (Tabela 1). Co-cultura de amebas foi utilizada pelo nosso grupo e outros, para analisar amostras ambientais, estações de tratamento de água e sistemas de distribuição de água. Uma ampla gama de microorganismos pode ser isolado, com esta técnica. As bactérias mais comuns isoladas por co-cultura amebas são membros do gênero Mycobacte…

Discussion

Co-cultura de amebas e enriquecimento amebas são métodos eficientes que permitiram o isolamento de muitas novas espécies de bactérias e amebas. Os resultados obtidos com estes métodos confirmam a presença ubíqua de ambos amebas e bactérias resistentes ameba do ambiente, e mais interessante em redes de água feitos pelo homem, que são considerados para ser controlada por meio de tratamentos químicos tais como a cloração e ozonização. Co-cultura de amebas e enriquecimento amebas são ferramentas essenciais p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Pr. Bernard La Scola para conselhos técnicos úteis e interessante discussão sobre co-cultura amebas e enriquecimento amebas. Agradecemos também o Dr. Vincent Thomas por sua ajuda na implementação da técnica em nosso laboratório.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 108342
0.22 μm pore size membrane Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCVPU11RE
proteose peptone Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 211693
yeast extract Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 212750
Cell culture flasks Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 353135
Kova slide Hycor, Indianapolis, IN 87144
cell culture microplates Corning Inc, Corning, NY 3524
Diff-Quik staining kit Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany 130832
Ziehl fuchsin Fluka, St-Louis, MI 21820
basic fuchsin Sigma, St-Louis, MI 857843
Phenol Sigma, St-Louis, MI P1037 Corrosive and mutagenic
malachite green oxalate Fluka, St-Louis, MI 63160
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 15710
Saponin Sigma, St-Louis, MI 84510

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Cite This Article
Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches. J. Vis. Exp. (80), e51055, doi:10.3791/51055 (2013).

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